杜氏肌營養(yǎng)不良癥dmd與遺傳

1、,蛋白結構缺陷引起的疾病Maladies dues aux défauts des proteins de structure,——Dystrophies musculaires de Duchenne et Becker,,疾病概述,,Dystrophie musculaire de Duchenne,DMD，杜氏肌營養(yǎng)不良，假肥大型肌營養(yǎng)不良Dystrophine（Dys） 抗肌萎縮蛋白 缺失Maladie

2、monogeniqueHétédité: XRDuchenne, un neurologiste français, a donné une description complète de 13 maladies attaints,Phénotype Clinique de la DMD,Les muscles jumeaux des jambs des gar

3、çons atteints apparaissent qu’ils soient développésMais asthéniques假性肌肥大Tissu conjonctif et la graisse,Phénotype Clinique de la DMD,1~2 ans normal3 ~ 5 ans

4、 développe une faiblesse musculaire Dès l’âge de 12 ans confiné en chaise roulant Au-delà de l’âge de 20 ans ne survivraQI 智商 une chute mod&

5、#233;ré d’environ 20 points,,LabCréatine kinase (niveau sérique)血清濃度 50~ 100 fois la limite supérieure de la normale dans les stades préco

6、ces,Dystrophie musculaire de Becker,le gène de la dystrophie Beaucoup plus atténué 緩和 Après l’âge de 16 ans parvient à marcher 之后多年也可行走,DMD與BMD的差異,DMD——致死BMD——存活率非常高(70%),易產(chǎn)生

7、 新的突變,,遺傳,,遺傳特征,Hétédité: XR,遺傳特征,（1）系譜中常常只有男性患者（2）父母都無病時，女兒則不會發(fā)病，兒子可能發(fā)??；（3）由于交叉遺傳，患者的同胞、舅舅、姨表兄弟、外甥常常為本病患者；（4）由于男性患者的子女都正常，故可見隔代遺傳；（5）女性患者的父親一定是患者,母親一定是攜帶者。,DMD —男女差異,男性致死1/3 néomutation,2/3 m&

8、#232;re porteuse女性攜帶者 Majorité 無任何臨床表現(xiàn)，70% 肌酸激酶(Créatine kinase ) 增高8% 輕微的肌肉癥狀,有些還有嚴重的近心端肌肉障礙。女性很少患有DMD,母系鑲嵌,某男性是家族中DMD的先證者他的母親沒有攜帶突變基因遺傳位點上發(fā)生了新近的突變大約5%-15%的這些發(fā)生的例子是由于母系生殖鑲嵌,DMD —發(fā)病率較高,Garçons nou

9、veau-nés：1/3300Un taux de mutation ：1/10000每天一個男性每11-12秒會產(chǎn)生1個新突變的精子（8 x 107 par jour）,,基因與蛋白,,Gène DMD,人類最大的基因之一，2300 kb 位于Xp??占X 染色體全長的1.5%99% 的序列由內(nèi)含子組成編碼區(qū)包括79個外顯子及7 個組織特異性的啟動子其mRNA 序列長114 kb主要表達于骨骼肌、

10、心肌，少量表達于腦組織,7 個組織特異性的啟動子,,B( 腦皮質(zhì)) 、M( 肌組織) 、P( 蒲肯野纖維) 、R( 視網(wǎng)膜) 、B3( 腦組織) 、S(施旺細胞)和G( 肌組織之外的多種組織器官)B 型：大腦皮層、海馬回神經(jīng)元P型：小腦蒲肯野細胞, 在骨骼肌也有極少量的表達M 型：骨骼肌、心肌組織, 同時在腦神經(jīng)膠質(zhì)細胞也有少量表達,Dystrophin 抗肌萎縮蛋白,全長型dystrophin 是一種427 kDa的棒狀蛋白,

11、長約150 nm, 分為4 個區(qū)域，氨基端區(qū)域中央棒狀區(qū)富含半胱氨酸區(qū)域羧基端區(qū)域,,A. 位于Xp21, 黑色的豎線代表分布于整個基因上的79 個外顯子, 黑色箭頭指示各組織特異性啟動子不同的啟動位點, 分別以不同的字母縮寫來代表, B( 腦皮質(zhì)) 、M( 肌組織) 、P( 蒲肯野纖維) 、R( 視網(wǎng)膜) 、B3( 腦組織) 、S( 施旺細胞)和G( 肌組織之外的多種組織器官) 。B. 不同形式的dystrophin 蛋白及

12、其區(qū)域組成, 氨基端、中央棒狀區(qū)域、富含半胱氨酸區(qū)域及羧基端區(qū)域,,DMD患者：60%基因突變表現(xiàn)為缺失一般在基因的5’端和中央棒區(qū)兩個區(qū)域BMD患者：可能缺失了一個或者幾個基因序列dystrophine蛋白的特點DMD患者體內(nèi)很少或者沒有BMD患者體內(nèi)有表達，但是仍然比正常人少,,,臨床治療,,DMD治療,目前為止尚無治療DMD的有效方法藥物治療（對癥治療）：糖皮質(zhì)激素治療短期口服激素治療可增強骨骼肌力量和功能，并可能在

13、更長時間內(nèi)穩(wěn)定骨骼肌力量和功能基因治療：利用不直接引起人類疾病，免疫原性較小的腺相關病毒（AAV）為載體，導入人工剪裁的Dys基因修正肌肉組織(占全身體重40％)的基因缺陷遇到各種各樣的困難康復治療、矯形治療、社會心理治療等,,臨床檢測,,產(chǎn)前診斷和雜合子診斷,90%攜帶者孕婦中產(chǎn)前診斷可能有至少95%的精確度由于基因突變導致基因的缺失或者多倍體的家庭中，60%-70%可以直接通過southern印跡雜交技術或者PCR技術來測量

14、胎兒的DNA得到在其余的基因缺失不能明確診斷出來的家庭中，可以通過鍵的標記來完成產(chǎn)前診斷與患病男性結婚的女性中75%的女性：DNA檢查、CK血清濃度檢查——胎兒是否攜帶25%女性難檢測：第一，在病程的一些時期，基因缺陷是無法被檢查出來的（可能情況就是等位基因是正常的或者突變的等位基因位于另外一條X染色體上）第二，一些家庭的一些成員的樣本丟失了第三，兩個標記基因之間的基因重組在X染色體傳入下一代之前發(fā)生了（母系鑲嵌）,產(chǎn)前檢

15、測,生物化學檢查——CK血清濃度基因診斷多重PCRSouthern blot探針連接多重擴增(MLPA)變性高效液相色譜(DHPLC)抗肌萎縮蛋白的免疫組化,多重PCR方法——DMD、BMD相關基因的缺失、重復,可直接檢出DMD／BMD的缺失型突變65％的患者為基因缺失所致多重PCR:使用多對引物的針對DMD基因的缺失熱區(qū)，利用多對PCR引物在一個PCR管中同時擴增多個外顯子，通過和正常對照相比較而判斷外顯子的缺失情況

16、,多重PCR方法,優(yōu)點：1、具有敏感、特異性強和可重復性好的優(yōu)點2、需要的DNA量少、操作簡單局限性:1. 女性攜帶者——正常x染色體的屏蔽效應，無法檢出2.多重PCR體系內(nèi)，由于引物之間的相互競爭，有時也會出現(xiàn)個別片段擴增的假陰性結果。（對初次擴增呈陰性結果的片段進行再次擴增，以驗證結果的準確性）,Southern blot方法——DMD、BMD相關基因的缺失、重復,是一種常用的DNA定量的分子生物學方法原理將待測的DN

17、A樣品固定在固相載體(硝酸纖維膜或尼龍膜)上與同位素標記的核酸探針進行雜交在與探針有同源序列的固相DNA的位置上顯示出雜交信號通過檢測信號的有無、強弱可以對樣品定性、定量，從而計算出轉入的拷貝數(shù),Southern blot方法,優(yōu)點：Southern雜交準確性高、特異性強缺點：1、不經(jīng)過靶片段的擴增(PCR)，一般每個電泳通道需要10~30μg的DNA，在實際操作中就需較大量的DNA樣品2、Soutllem雜交不能確定缺失的

18、準確外顯子范圍，對檢測女性重復突變(duplication)或三重重復(triplication)攜帶者存在困難3、由于DMD基因很大，需要6到8個cDNA探針，雜交反應才能覆蓋整個DMD基因，要1～2周時間用來分析，勞動量大4、需要使用放射性同位素作為示蹤物，會對工作環(huán)境帶來污染,多重探針連接依賴性擴增技術 MLPA,multiplex probe ligation dependent amplification原理針對所有需

19、要檢測突變的DNA序列，設計多對特異探針固定在尼龍膜上和待測樣品DNA雜交然后洗膜（正常序列和探針雜交后不被洗脫）利用連接酶把探針連接起來使用一套通用引物進行PCR擴增PCR產(chǎn)物用PCR儀進行分析，DNA片段的缺失／重復以及拷貝數(shù)以測序儀得到信號的有無及信號的峰高或面積進行計算,,優(yōu)點：可以在1個PCR管中完成多達40個外顯子的缺失／重復檢測專門用于DMD缺失／重復檢測的試劑盒，通過2個PCR反應就可以完成79個外顯子及其

20、非翻譯序列的缺失／重復突變篩查靈敏度高、操作簡單、可重復性好、經(jīng)濟快捷,DMD患者(A)及其母親(B)的20-47號外顯子的MLPA檢測結果,,變性高效液相色譜 DHPLC,denaturing high performance liquid chromatography原理用離子對逆向?qū)游龇ǚ蛛x并檢測異源雙鏈通過三乙基醋酸鈉（TEAA)作為橋分子，帶正電的氨基與核酸分子帶負電電荷的磷酸基相互作用，烷基端與色譜柱基質(zhì)表面的疏水基

21、團相連不同大小的DNA片段所含的磷酸根數(shù)目不同，與固定相的結合力不同隨著流動相中乙腈濃度(離子對／洗脫液的比值)的增加，DNA／TEAA與柱基質(zhì)的疏水作用力逐漸減弱，最終被洗脫下來檢測柱洗脫液在260 nm處的吸光度，樣品中各成分在色譜圖中顯示為不同的吸收峰優(yōu)點: 靈敏度高、分析快捷以及可以進行半自動化分析,,,,Merci de votre attention !,參考文獻,DMD／BMD基因診斷研究進展，徐曉雪 張朝東 李嘉