水稻轉(zhuǎn)座子Pong Pbi121-TPAS ihpRNA載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、學(xué)校代碼：10200分類號(hào)：Q94研究生學(xué)號(hào)：密級(jí)：⑧東北埽葒大謄碩士學(xué)位論文200821482玉水稻轉(zhuǎn)座子PongpBll21TPASihpRNA載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化TheconstructionofpBll21TI，ASihpRNAvectorofariceTnPongandAgrobacteriummediatedtransformationbyregenerationOIemDryonlcca兒US‘●●l●■●作者

2、：柴娜指導(dǎo)教師：學(xué)科專業(yè)：研究方向：學(xué)位類型：劉立俠教授植物學(xué)植物基因工程學(xué)歷碩士東北師范大學(xué)學(xué)位評(píng)定委員會(huì)2011年6月摘要轉(zhuǎn)座子是基因組內(nèi)可以移動(dòng)和擴(kuò)張的遺傳元件，是基因組中的重要組成部分，具有高度的重復(fù)性。近些年來，人們從水稻基因組中分離得到了一類很活躍的MITEs轉(zhuǎn)座子，即mPing。對(duì)mPing的研究將有助于我們對(duì)MITEs起源和轉(zhuǎn)座機(jī)制的理解，但是mPing本身不能編碼轉(zhuǎn)座酶，而是需要由與其相關(guān)的自主性轉(zhuǎn)座子提供，為其提供轉(zhuǎn)

3、座酶的是自主性轉(zhuǎn)座子Ping和Pong。為了進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)座子的作用，本文構(gòu)建了水稻pBll21TPASihpRNA載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化法獲得再生植株，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的表型進(jìn)行觀察和分子檢測(cè)，進(jìn)而探討轉(zhuǎn)座子在植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。根據(jù)水稻pong堿基序列(NCBI：BK000586)設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增方法，以水稻，總DNA為模板，擴(kuò)增了兩個(gè)目的基因片段TPAS1和TPAS2，兩片段長(zhǎng)度均為222bp。對(duì)目的片段序列進(jìn)行

4、鑒定，將片段1和片段2分別連接到中間載體pKANANIB臌體和pSP72載體上。從連有片段2的重組pSP72載體中酶切獲得片段3，并將其連接到連有片段1的重組pKANANIBAL載體上。最后將重組的pKANANIBAL載體進(jìn)行酶切，獲得含有內(nèi)含子的pong基因片段，最終裝載蟄JpBll21表達(dá)載體上，構(gòu)建成水稻pBll21TPASihpRNA表達(dá)載體。以水稻松前和124品種成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織為受體材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)將構(gòu)建的pon

5、g轉(zhuǎn)化載體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)基因植株。在本實(shí)驗(yàn)中，優(yōu)化了水稻遺傳轉(zhuǎn)化，確認(rèn)了農(nóng)桿菌最佳侵染濃度0D咖=02，侵染時(shí)間3min，共培養(yǎng)3d，預(yù)培養(yǎng)5—7d，卡納霉素篩選濃度35mg／L。本實(shí)驗(yàn)共獲得16株轉(zhuǎn)化植株，其中3株為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性，均是124品種，經(jīng)過PCR檢測(cè)，證實(shí)了外源基因已經(jīng)整合到水稻基因組中。從表型上來看，轉(zhuǎn)基因植株具有個(gè)體矮小，分蘗少，花期早，結(jié)籽率低的特點(diǎn)。經(jīng)過篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株，將為進(jìn)一步研究水稻轉(zhuǎn)座子的活性與表