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文檔簡(jiǎn)介
1、鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)引起的鴨、鵝、火雞及其它鳥類的一種高致病性、接觸性傳染病,給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,是目前危害養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。目前RA基因組序列已在Genbank中公布,預(yù)測(cè)編碼基因超過2000個(gè),但目前已知功能基因只有少數(shù)。大規(guī)模突變庫構(gòu)建成為高通量研究RA基因功能的主要工具。
本研究主要通過轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變的方法,構(gòu)建RA突變庫
2、,然后從基因水平上鑒定與鴨疫里默氏桿菌生物被膜形成有關(guān)的基因。主要內(nèi)容為通過結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將含轉(zhuǎn)座子質(zhì)粒Tn-x的大腸桿菌BW19851與本實(shí)驗(yàn)室分離保存的RA CH3進(jìn)行接合轉(zhuǎn)導(dǎo),使轉(zhuǎn)座子Tn-X隨機(jī)插入CH3基因組,以Tn-X上的紅霉素抗性進(jìn)行陽性結(jié)合子的篩選,構(gòu)建了一個(gè)包含2000株細(xì)菌的隨機(jī)突變株文庫,并最終計(jì)算轉(zhuǎn)導(dǎo)效率約為4×10-6。
對(duì)突變株文庫進(jìn)行生物被膜減少株的篩選,共獲得了生物被膜典型減少株38株,其生
3、物被膜的減少率呈現(xiàn)在40%-100%范圍內(nèi),推測(cè)這些被阻斷的基因可能在生物被膜形成過程的不同時(shí)期參與作用,從而使相應(yīng)突變株的生物被膜減少率呈現(xiàn)在不同范圍內(nèi)。其中生物被膜減少率達(dá)99%以上的突變株有五株。通過Genome walking等技術(shù)進(jìn)行插入位點(diǎn)的序列測(cè)定,最終成功鑒定出相關(guān)的插入位點(diǎn)。在所有鑒定出的插入位點(diǎn)中有四個(gè)基因至少重復(fù)出現(xiàn)2次,推測(cè)這幾個(gè)基因?qū)ι锉荒さ男纬善鹬匾淖饔?。Southern blot檢測(cè)轉(zhuǎn)座子Tn-X在基
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