青蒿素衍生物對(duì)抗原提呈細(xì)胞的促凋亡作用及機(jī)制探究.pdf

1、研究目的：體外探討青蒿琥酯（ART）對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）和單核-巨噬細(xì)胞的促凋亡作用及凋亡途徑；體內(nèi)探討青蒿琥酯對(duì)DSS結(jié)腸炎小鼠腸粘膜固有層單個(gè)核細(xì)胞（LPMC）凋亡的影響。
　　內(nèi)容和方法：（1）體外誘導(dǎo)小鼠骨髓細(xì)胞（BMC）向樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）方向分化以得到大量高純度DC。培養(yǎng)液中添加LPS和/或ART，收集細(xì)胞提取蛋白，Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（caspase3，caspase8，caspase9，PARP

2、）的表達(dá)水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DC成熟相關(guān)的表面標(biāo)記（CD86、MHCII、CD40、CD80）的表達(dá)水平。（2）小鼠腹腔注射1ml3％硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，4天后分離腹腔巨噬細(xì)胞（MQ）并進(jìn)行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)液中添加LPS和/或ART，收集培養(yǎng)液上清檢測(cè)腫瘤壞死因子（TNF）-?的表達(dá)量；收集細(xì)胞提取蛋白，Western blot檢測(cè)caspase3的表達(dá)水平。采用人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系(THP-1），培養(yǎng)液中添加ART，CCK-8檢測(cè)細(xì)

3、胞數(shù)量變化，流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡與否，Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（caspase3，caspase8，caspase9，PARP）的表達(dá)水平；并加入全caspase抑制劑（z-VAD-fmk），流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞凋亡水平的變化。（3）予小鼠3%葡聚糖硫酸鈉（DSS）飲水5天以建立結(jié)腸炎模型，125 mg/k g/天ART或等量生理鹽水連續(xù)灌胃10天，第10天處死小鼠，提取腸粘膜固有層單個(gè)核細(xì)胞（LPMC），流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

4、DC和MQ細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞凋亡比例的變化。
　　結(jié)果：（1）對(duì)于DC，ART可以激活內(nèi)源性凋亡途徑相關(guān)的caspase9，進(jìn)而激活效應(yīng)性caspase3，刺激PARP活化，引起細(xì)胞凋亡；但是，ART對(duì)DC的細(xì)胞成熟沒(méi)有顯著影響。（2）對(duì)于腹腔MQ，ART降低LPS活化的MQ產(chǎn)生TNF-?的水平，但不能引起caspase3活化。但對(duì)于THP-1，ART抑制其細(xì)胞增殖；促進(jìn)其凋亡；主要通過(guò)激活內(nèi)源性凋亡途徑相關(guān)的caspase9，進(jìn)而激

5、活效應(yīng)性caspase3，引起PARP活化，最終引起凋亡，而caspase8并無(wú)激活；用全caspase抑制劑z-VAD-fmk作用之后，ART促THP-1細(xì)胞凋亡的作用顯著降低。（3）對(duì)于LPMC，DC和MQ的細(xì)胞數(shù)量在 DSS模型組比正常對(duì)照組顯著升高。在DSS結(jié)腸炎小鼠中，ART能顯著減少DC和MQ的細(xì)胞數(shù)量、顯著促進(jìn)DC和MQ的細(xì)胞凋亡，但對(duì)非炎癥狀態(tài)下的DC和MQ的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞凋亡均沒(méi)有顯著影響。
　　結(jié)論：（1）在體

6、外，ART通過(guò)內(nèi)源性凋亡途徑引起DC凋亡，但是對(duì)DC的成熟沒(méi)有顯著影響；ART顯著降低 LPS活化的腹腔 MQ產(chǎn)生 TNF-?，但不引起MQ凋亡；ART可減少THP-1細(xì)胞數(shù)量，并通過(guò)內(nèi)源性凋亡途徑促進(jìn)THP-1細(xì)胞凋亡。（2）在體內(nèi)，DSS結(jié)腸炎LPMC中DC和MQ的細(xì)胞數(shù)量顯著升高；ART能通過(guò)顯著促進(jìn)DSS結(jié)腸炎小鼠中DC和MQ的細(xì)胞凋亡從而顯著減少DC和MQ的細(xì)胞數(shù)量；但對(duì)非炎癥狀態(tài)下的DC和MQ的細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞凋亡均沒(méi)有顯著影