青蒿素衍生物對抗原提呈細胞的促凋亡作用及機制探究.pdf

1、研究目的：體外探討青蒿琥酯（ART）對樹突狀細胞（DC）和單核-巨噬細胞的促凋亡作用及凋亡途徑；體內(nèi)探討青蒿琥酯對DSS結(jié)腸炎小鼠腸粘膜固有層單個核細胞（LPMC）凋亡的影響。
　　內(nèi)容和方法：（1）體外誘導(dǎo)小鼠骨髓細胞（BMC）向樹突狀細胞（DC）方向分化以得到大量高純度DC。培養(yǎng)液中添加LPS和/或ART，收集細胞提取蛋白，Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白（caspase3，caspase8，caspase9，PARP

2、）的表達水平；流式細胞術(shù)檢測DC成熟相關(guān)的表面標(biāo)記（CD86、MHCII、CD40、CD80）的表達水平。（2）小鼠腹腔注射1ml3％硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基，4天后分離腹腔巨噬細胞（MQ）并進行體外培養(yǎng)，培養(yǎng)液中添加LPS和/或ART，收集培養(yǎng)液上清檢測腫瘤壞死因子（TNF）-?的表達量；收集細胞提取蛋白，Western blot檢測caspase3的表達水平。采用人急性單核細胞白血病細胞系(THP-1），培養(yǎng)液中添加ART，CCK-8檢測細

3、胞數(shù)量變化，流式細胞術(shù)觀察細胞凋亡與否，Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白（caspase3，caspase8，caspase9，PARP）的表達水平；并加入全caspase抑制劑（z-VAD-fmk），流式細胞術(shù)觀察細胞凋亡水平的變化。（3）予小鼠3%葡聚糖硫酸鈉（DSS）飲水5天以建立結(jié)腸炎模型，125 mg/k g/天ART或等量生理鹽水連續(xù)灌胃10天，第10天處死小鼠，提取腸粘膜固有層單個核細胞（LPMC），流式細胞術(shù)檢測

4、DC和MQ細胞數(shù)量及細胞凋亡比例的變化。
　　結(jié)果：（1）對于DC，ART可以激活內(nèi)源性凋亡途徑相關(guān)的caspase9，進而激活效應(yīng)性caspase3，刺激PARP活化，引起細胞凋亡；但是，ART對DC的細胞成熟沒有顯著影響。（2）對于腹腔MQ，ART降低LPS活化的MQ產(chǎn)生TNF-?的水平，但不能引起caspase3活化。但對于THP-1，ART抑制其細胞增殖；促進其凋亡；主要通過激活內(nèi)源性凋亡途徑相關(guān)的caspase9，進而激

5、活效應(yīng)性caspase3，引起PARP活化，最終引起凋亡，而caspase8并無激活；用全caspase抑制劑z-VAD-fmk作用之后，ART促THP-1細胞凋亡的作用顯著降低。（3）對于LPMC，DC和MQ的細胞數(shù)量在 DSS模型組比正常對照組顯著升高。在DSS結(jié)腸炎小鼠中，ART能顯著減少DC和MQ的細胞數(shù)量、顯著促進DC和MQ的細胞凋亡，但對非炎癥狀態(tài)下的DC和MQ的細胞數(shù)量和細胞凋亡均沒有顯著影響。
　　結(jié)論：（1）在體

6、外，ART通過內(nèi)源性凋亡途徑引起DC凋亡，但是對DC的成熟沒有顯著影響；ART顯著降低 LPS活化的腹腔 MQ產(chǎn)生 TNF-?，但不引起MQ凋亡；ART可減少THP-1細胞數(shù)量，并通過內(nèi)源性凋亡途徑促進THP-1細胞凋亡。（2）在體內(nèi)，DSS結(jié)腸炎LPMC中DC和MQ的細胞數(shù)量顯著升高；ART能通過顯著促進DSS結(jié)腸炎小鼠中DC和MQ的細胞凋亡從而顯著減少DC和MQ的細胞數(shù)量；但對非炎癥狀態(tài)下的DC和MQ的細胞數(shù)量和細胞凋亡均沒有顯著影