血循環(huán)miRNAs與心肌梗死和缺血性腦卒中的相關(guān)性分析.pdf

1、研究背景：微小RNAs（miRNAs）是一類(lèi)相對(duì)新的內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼小RNA分子，它們可以通過(guò)結(jié)合到mRNA的3'非編碼區(qū)調(diào)控靶基因的表達(dá)。miRNAs已被證實(shí)在新陳代謝、細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。然而，成熟miRNAs結(jié)合到靶mRNA的特定區(qū)域?qū)е路g抑制或mRNA降解機(jī)制并未完全清楚闡明?，F(xiàn)有研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)人類(lèi)基因組編碼超過(guò)1000個(gè)的miRNAs，其表達(dá)有一定的組織或細(xì)胞類(lèi)型特異性。研究表明， miRNAs已經(jīng)在廣

2、泛的人類(lèi)疾病中觀察到變化，包括自身免疫，炎癥，神經(jīng)變性和心血管疾病。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，大量證據(jù)表明心臟特異性miRNA，如miR-1，miR-133a/b和miR-208等，參與調(diào)控心臟發(fā)育及影響心血管疾病，包括急性心肌梗死（AMI）。最近的研究表明，無(wú)論是在人類(lèi)和動(dòng)物，一些miRNAs存在于體循環(huán)中。已有報(bào)道顯示一些循環(huán)miRNAs表達(dá)水平在懷孕期間和在多種癌癥或心血管疾病存在差異性。心血管系統(tǒng)疾病中，急性心肌梗死具有發(fā)病急、高死亡率

3、等特點(diǎn)，因此實(shí)現(xiàn)AMI的早期診斷將具有重要的臨床價(jià)值。迄今，一些生物標(biāo)志物已在診斷AMI中被應(yīng)用，例如，心肌肌鈣蛋白I（cTnI）、CK-MB等。但是，miRNAs在急性心肌梗死患者血漿中水平如何，是否可以提高診斷急性心肌梗死靈敏度或者特異性還較少研究。近來(lái)報(bào)道，冠狀動(dòng)脈病或糖尿病引起的心肌損傷可以引起多種miRNA（miR-1，miR-133，miR-499，miR-208）在血循環(huán)的表達(dá)水平發(fā)生改變。
　　急性心肌梗死（AMI

4、）是最嚴(yán)重的一種心血管疾病。早期，準(zhǔn)確的診斷可以保證得到及時(shí)再灌注治療因此可以明顯減少死亡率。最近的研究表明，循環(huán)心肌源性的miRNAs可能是梗死的潛在生物標(biāo)志物。最近有研究證明，在急性心肌梗死人和小鼠的血漿中miR-1，miR-133a/b，和miR-499-5p發(fā)生改變。這些結(jié)果表明miRNAs可參與心肌疾病的病理生理過(guò)程。然而，血循環(huán)miR-30a,miR-195,let-7b,miR-1和miR-126在急性心肌梗死的水平仍然是

5、有待研究。
　　因此，將探討血循環(huán)中miR-30a,miR-195,let-7b,miR-1 miR-126在急性心肌梗死發(fā)生過(guò)程中是否有顯著的表達(dá)差異、是否與急性心肌梗死過(guò)程密切相關(guān)，以及作為實(shí)現(xiàn)對(duì)AMI早期診斷標(biāo)志物的可能性。
　　研究方法：（1）本項(xiàng)目2009年10月至2010年5月獲得同濟(jì)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在病人及家屬簽署了知情同意后執(zhí)行。（2）入選急性心肌梗死患者18名，健康成人30名作為對(duì)照。 AMI患者的血液

6、樣品在發(fā)病后4小時(shí)、8小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)和1周分別采取外周靜脈血5ml；健康對(duì)照組同樣采血。離心法分離血漿并保持在-80℃直至RNA提取。（3）用TRIzol LS試劑提取總RNA；（4）用Real-Time PCR方法檢測(cè)血漿miRNA水平，用2-ct法計(jì)算相對(duì)于miRNAs的表達(dá)水平。（5）用ELISA方法測(cè)定血漿cTnI的濃度。（6）所有的統(tǒng)計(jì)分析均采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0。獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)用于兩個(gè)組進(jìn)

7、行比較。其中≧3組參數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量ANOVA分析。對(duì)于分類(lèi)變量，卡方檢驗(yàn)。miRNAs與心肌肌鈣蛋白Ⅰ時(shí)間過(guò)程的趨勢(shì)是由重復(fù)測(cè)量方差分析。用ROC曲線(xiàn)下面積（AUC）測(cè)量來(lái)判斷miRNA診斷心肌梗死的特異性和敏感性。
　　研究結(jié)果：（1）采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法，分析了AMI患者和健康的成年人三種mi-RNAs（MIR-30A，miR-195和let-7b）的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，急性心肌梗死患者和健康成人后4小時(shí)后miR-

8、30a，miR-195和let-7b的表達(dá)顯著增高。在4小時(shí)，8小時(shí)和12小時(shí)，AMI患者血漿的miR-30a是對(duì)照組1.4倍，10.48倍和1.45倍。同樣，AMI組與對(duì)照組相比，在8小時(shí)和12小時(shí)， miR-195表現(xiàn)出10.2倍和1.4倍增長(zhǎng)。miR-30a和miR-195在急性心肌梗死的血漿水平在各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較，在8小時(shí)達(dá)到達(dá)高峰。（2）與血漿cTnI的比較分析顯示，在AMI患者中，miR-1，miR-126升高和cTnI顯著

9、相關(guān)，表現(xiàn)為相同的趨勢(shì)。(3)引入ROC曲線(xiàn)以確定miRNA診斷急性心肌梗死的特異性和敏感性。由于miRNA的表達(dá)水平的檢測(cè)可同時(shí)受技術(shù)和生物的變化的影響，用三個(gè)循環(huán)miRNA的組合的表達(dá)水平用一個(gè)單一的分?jǐn)?shù)，稱(chēng)為復(fù)合體miRNA-得分，以提供一個(gè)改善信號(hào)。在8小時(shí)和12小復(fù)合的miRNA的平均得分在AMI組分別是2.93和2.96和對(duì)照組分別是1.53和1.56。該復(fù)合miRNA的分?jǐn)?shù)來(lái)區(qū)分AMI組的能力，從對(duì)照組顯示通過(guò)ROC曲線(xiàn)為

10、AUC0.93和0.92。通過(guò)使用1.815和2.025閾值分?jǐn)?shù)，進(jìn)行了患者預(yù)測(cè)AMI，特異性為94％和90％，靈敏度為90％和90％。（4）這miR-1的分?jǐn)?shù)和miR-126的分?jǐn)?shù)代表了其在血漿的表達(dá)水平。在4小時(shí)，8小時(shí)，12小時(shí)，24小時(shí)，48小時(shí)和72小時(shí)，用miR-1的分?jǐn)?shù)診斷急性心肌梗塞，其ROC曲線(xiàn)的AUC分別是0.92，0.90，0.94，0.92，0.96和0.90。在AMI組，取得了靈敏度分別為93％，93％，94％

11、，93％，93％和90％及特異性分別為90％，90％，93％，90％，90％和90％；miR-126的ROC曲線(xiàn)的AUC分別是0.86，0.87，0.88，0.87，0.84和0.83。AMI組，獲得了特異性分別為78％，84％，88％，77％，80％，70％以及靈敏度分別為81％，81％，81％，81％，81％和81％。
　　研究結(jié)論：結(jié)果揭示血循環(huán)miR-30a,miR-195,let-7b,miR-1和miR-126表達(dá)水平

12、的變化與經(jīng)典的心肌標(biāo)志物cTnI一致，與心肌梗死密切相關(guān)，因此具有用于診斷AMI的潛在臨床價(jià)值。
　　第二部分在人類(lèi)缺血性腦卒中血循環(huán)中的miR-30a，miR-126和let-7b作為生物標(biāo)志物
　　研究背景：在發(fā)達(dá)國(guó)家，中風(fēng)是導(dǎo)致人們死亡和殘疾的首要原因。其中，缺血性腦卒中約占中風(fēng)患者的80％。.而在中國(guó)，每年有2500000人患缺血性腦卒中并且約1000000死于腦卒中。與冠心病類(lèi)似，傳統(tǒng)的腦卒中危險(xiǎn)因素包括年齡、高血

13、脂、高血壓、糖尿病、吸煙、酗酒等。miRNA是小分子非蛋白編碼RNA家族，通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA的3'非翻譯區(qū)來(lái)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。研究證實(shí)，miRNA參與大量病理生理進(jìn)程，例如：發(fā)育、分化、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移。然而，與腫瘤和心血管疾病相比，很少有研究報(bào)道m(xù)iRNA與腦死亡、變性、或缺血性腦卒中之間的聯(lián)系。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅 Dicer酶的缺乏，可發(fā)生神經(jīng)元的逐漸變性，而其靶基因miR-8則可以調(diào)節(jié)miRNA生成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，從而阻止神經(jīng)元變性。

14、此外，miR-146 A/G等位基因也被證實(shí)和缺血性卒中相關(guān)。大鼠實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)miR-195可通過(guò)抗淀粉樣作用對(duì)慢性腦低灌注誘導(dǎo)的的老年性癡呆具有保護(hù)作用。
　　Jeya seelan等報(bào)道，miRNA可以參與調(diào)節(jié)SD大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞的病理生理機(jī)制。其研究發(fā)現(xiàn)在大腦中動(dòng)脈阻塞24小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)再灌注，miR-30a-3p的表達(dá)是下調(diào)，而48小時(shí)再灌注，miR-30a-3p的表達(dá)則是上調(diào)。同時(shí)，最近研究表明miR-30家族可以調(diào)節(jié)血管

15、的生成。此外，研究還發(fā)現(xiàn)在青年腦卒中的病人， miR-12表達(dá)水平出現(xiàn)明顯的下調(diào)。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株，LIN28B和let-7這兩種miRNA的表達(dá)與rs17065417的基因型相關(guān)。而其他研究發(fā)現(xiàn)Let-7可以激活Toll-like受體7有助于神經(jīng)系統(tǒng)損傷的恢復(fù)。
　　急性心肌梗塞和缺血性腦卒中有著類(lèi)似的病理生理過(guò)程，前期的研究表明，血漿miRNA濃度可能是心肌梗死的潛在標(biāo)志物。在心肌梗塞早期階段檢測(cè)血循環(huán)miR-30a,mi

16、R-126和let-7b的表達(dá)水平發(fā)生異常改變，對(duì)診斷急性心肌梗死病人有高度的特異性和敏感性。然而，miR-30a,miR-126和let-7b是否參與了缺血性腦卒中病理生理進(jìn)程以及其表達(dá)水平是否也發(fā)生改變還未見(jiàn)報(bào)道。
　　因此，將在本研究探討miR-30a,miR-126和let-7b在缺血性腦卒中發(fā)生過(guò)程中是否有顯著的表達(dá)差異，以及作為實(shí)現(xiàn)對(duì)缺血性腦卒中早期診斷的標(biāo)志物的可能性。
　　研究方法：（1）本項(xiàng)目在獲得同濟(jì)醫(yī)院

17、倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，病人及家屬簽署了知情同意書(shū)后執(zhí)行。從同濟(jì)醫(yī)院分別收集缺血性腦卒中和健康對(duì)照合計(jì)247例樣本，抽取5ml靜脈血作為研究標(biāo)本。本研究病例為腦梗死患者，診斷是根據(jù)國(guó)際經(jīng)典診斷標(biāo)準(zhǔn)，影像學(xué)檢查是由經(jīng)驗(yàn)豐富的神經(jīng)放射學(xué)專(zhuān)家確認(rèn)。（2）用CT法分別計(jì)算并比較miRNA的相對(duì)表達(dá)水平。為了避免所提取RNA量存在差異，使用小核RNA（U6）作為內(nèi)參來(lái)對(duì)miRNA表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化。（3）相對(duì)miRNA的表達(dá)水平用2-CT法進(jìn)行計(jì)算。

18、獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)用于兩個(gè)組進(jìn)行比較。對(duì)于分類(lèi)變量采用卡方檢驗(yàn)。一種復(fù)合得分（表示為miRNA表達(dá)水平總得分）定義來(lái)表示所述miRNA的累積水平。所述miRNA-得分分別為所有病例對(duì)照組內(nèi)樣品的miRNA表達(dá)水平的總和。所述miRNA的復(fù)合得分，并通過(guò)減去一個(gè)常數(shù)（最小得分）調(diào)整，以使所有分?jǐn)?shù)中的最小值為0。并用ROC曲線(xiàn)（AUC）下面積作為判斷miRNA診斷腦梗死的特異性和敏感性的統(tǒng)計(jì)工具。所有的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)都采用P<0.05（95％CI）作

19、為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異水準(zhǔn)。所有統(tǒng)計(jì)分析使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0(Statistical Package for the Social Sciences,Chicago,Ill)。
　　研究結(jié)果：（1）miRNA在缺血性腦卒中的表達(dá)水平：分別測(cè)量miR-30a,miR-126和let-7b在缺血性腦卒中和健康對(duì)照組的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)miR-30a,miR-126和let-7b在48周和對(duì)照組沒(méi)有明顯差異，而在24小時(shí),1周,4周和

20、24周，.同對(duì)照組相比，缺血性腦卒中患者miR-30a,miR-126表達(dá)下調(diào)。在24小時(shí)、1周、4周和24周，miR-30a在所有缺血性腦卒中組比對(duì)照組低45％-79％，而miR-26在所有缺血性腦卒中組比對(duì)照組低85％-98％。值得注意是數(shù)據(jù)顯示let-7b在缺血性腦卒中患者血循環(huán)的表達(dá)水平在不同腦卒中亞型中并不相同。
　?。?）miRNA的特異性和敏感性：由于miRNA的表達(dá)可能會(huì)受技術(shù)和其他因素的影響，不同亞型的腦卒中所測(cè)

21、定miRNA在同一時(shí)間點(diǎn)用一個(gè)分?jǐn)?shù)來(lái)定義可能會(huì)因此具有不同偏差缺乏穩(wěn)定性。用miRNA分?jǐn)?shù)代表let-7b-SA,let-7b-CEmb和let-7b-UDN的累計(jì)水平。與對(duì)照組比較，缺血性腦卒中的miRNA分?jǐn)?shù)具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。為了確定miRNA診斷腦卒中的特異性和敏感性，引入ROC曲線(xiàn)進(jìn)行分析研究。在24小時(shí),1周,4周和24周，miR-30a的ROC的AUC分別是0.91(95％CI=0.869-0.979),0.91(95％

22、CI=0.848-0.971),0.92(95％CI=0.856-0.976)和0.93(95％CI=0.875-0.984)。得到敏感性分別為94％,93％,90％，而特異性分別是80％,84％,84％和84％。MiR-126的ROC的AUC分別是0.92(95％CI=0.871-0.978),0.94(95％CI=0.895-0.985),0.93(95％CI=0.878-0.982)和0.92(95％CI=0.864-0.977)

23、。診斷缺血性腦卒中的敏感性分別是92％,90％,92％和92％，特異性分別是84％,86％,84％和82％。Let-7b的ROC的AUC分別是0.93(95％CI=0.879-0.980),0.92(95％CI=0.866-0.98),0.92(95％CI=0.858-0.98)和0.91(95％CI=0.849-0.97)。因此用于診斷缺血性腦卒中的敏感性分別是92％,90％,92％和89％，特異性分別是84％,84％,86％和80％