2-BFI減輕EAE小鼠CNS損傷與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化及iNOS和COX-2表達(dá)有關(guān).pdf

1、目的:觀察咪唑啉2受體(I2R)配體2-(2-苯并呋喃基)-2-咪唑啉(2-BFI)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，探索2-BFI減輕EAE的可能藥理學(xué)作用。
　　方法:將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組(saline)、EAE對(duì)照組(EAE-saline)和2-BFI干預(yù)組(EAE-2BFI)，每組9只。EAE對(duì)照組和2-BFI干預(yù)組用MOG35-55與CFA混合抗原乳

2、劑免疫小鼠制作EAE模型，正常對(duì)照組小鼠用生理鹽水與CFA混合抗原乳劑進(jìn)行免疫。2-BFI干預(yù)組于EAE造模后第0天開(kāi)始，按20mg/kg給予腹腔注射2-BFI，2次/天，連續(xù)14天。正常對(duì)照組和EAE對(duì)照組用等量的生理鹽水替換2-BFI以同樣的方法腹腔注射14天。免疫當(dāng)日定為第0天，每日觀察并記錄動(dòng)物行為學(xué)變化。各組動(dòng)物于發(fā)病高峰期統(tǒng)一處死，取腦、脊髓和視神經(jīng)進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)檢測(cè):蘇木素-伊紅(HE)染色觀察中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);Lu

3、xol Fast Blue染色觀察髓鞘脫失;透射電子顯微鏡觀察神經(jīng)元、血腦屏障(BBB)及視神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)變化;免疫組織化學(xué)方法測(cè)定小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物Iba-1和iNOS蛋白的表達(dá)水平;Real-time PCR法測(cè)定iNOS和COX-2 mRNA的表達(dá)水平;比色法檢測(cè)丙二醛(MDA)的含量;并對(duì)神經(jīng)功能缺損癥狀評(píng)分、活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量、iNOS蛋白、COX-2和iNOS mRNA表達(dá)水平進(jìn)行線性相關(guān)分析。
　　結(jié)果:
　　

4、1.行為學(xué)觀察:正常對(duì)照組小鼠未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀;EAE對(duì)照組小鼠最早發(fā)病開(kāi)始于免疫后第9天，表現(xiàn)為活動(dòng)減少、食欲減退，繼而表現(xiàn)出尾部肌力下降、尾巴拖地不能抬起、步態(tài)異常、后肢無(wú)力、癱瘓。各組動(dòng)物EAE誘發(fā)率分別為:正常對(duì)照組(0/9)，EAE對(duì)照組(9/9)，2-BFI干預(yù)組(6/9)，2-BFI干預(yù)后EAE的誘發(fā)率呈下降趨勢(shì);2-BFI干預(yù)組平均潛伏期為13.67±1.15天，與EAE對(duì)照組(13.63±1.21)比較無(wú)顯著性差

5、異;但2-BFI干預(yù)組日均神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯低于EAE對(duì)照組(p＜0.01)，最大神經(jīng)功能缺損評(píng)分為4.00±1.36天，較EAE對(duì)照組(11.88±1.42)亦明顯降低（p＜0.01）。
　　2.病理學(xué)改變:正常對(duì)照組小鼠未觀察到炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及髓鞘脫失。HE染色示EAE對(duì)照組脊髓內(nèi)有許多炎性病灶，病灶處小血管周?chē)写罅康难仔约?xì)胞浸潤(rùn)，成“袖套”樣改變，伴有脊膜增厚。從形態(tài)學(xué)上看，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞以淋巴細(xì)胞為主，可見(jiàn)一定量的巨噬細(xì)

6、胞。2-BFI干預(yù)組小鼠脊髓內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量明顯減少，病理評(píng)分為1.35±0.69，較EAE對(duì)照組(2.60±0.90)明顯降低(p＜0.01)。EAE對(duì)照組Luxol Fast Blue染色可見(jiàn)髓鞘有不同程度脫失，2-BFI干預(yù)組髓鞘脫失嚴(yán)重程度較EAE對(duì)照組減輕。
　　3.透射電子顯微鏡觀察結(jié)果:正常對(duì)照組小鼠神經(jīng)元、BBB及視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)正常。神經(jīng)元細(xì)胞核核內(nèi)染色質(zhì)聚集邊集，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)附著的核糖體數(shù)和線粒體數(shù)量減少，部分線

7、粒體水腫;EAE對(duì)照組腦組織微血管內(nèi)皮細(xì)胞核固縮，緊密連接擴(kuò)張，吞飲小泡數(shù)量增多，有的可見(jiàn)連接內(nèi)皮細(xì)胞的基質(zhì)和基膜斷裂，微血管周?chē)哪z質(zhì)細(xì)胞偽足腫脹，微血管管腔狹窄; EAE對(duì)照組小鼠視神經(jīng)髓鞘結(jié)構(gòu)松散、斷裂或融合，2-BFI干預(yù)組小鼠神經(jīng)元、BBB及視神經(jīng)損傷程度與EAE對(duì)照組相比均減輕。
　　4.免疫組化結(jié)果:與正常對(duì)照組相比，EAE對(duì)照組小鼠CNS內(nèi)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量及iNOS蛋白表達(dá)明顯增加(p＜0.01);與EAE對(duì)照

8、組相比，2-BFI干預(yù)組活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量（p＜0.05）及iNOS蛋白表達(dá)（p＜0.01）明顯減少。
　　5.Real-time PCR結(jié)果:與正常對(duì)照組相比，EAE對(duì)照組小鼠CNS內(nèi)iNOS和COX-2 mRNA表達(dá)水平明顯增加(p＜0.01);與EAE對(duì)照組相比，2-BFI干預(yù)組小鼠CNS內(nèi)iNOS和COX-2 mRNA表達(dá)水平降低，并有顯著性差異(p＜0.05)。
　　6.MDA檢測(cè)結(jié)果:EAE對(duì)照組小鼠CNS內(nèi)M