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文檔簡介
1、目的:
本課題以腸組織MSCs為中心,試圖通過建立腸組織MSCs體外分離培養(yǎng)技術(shù),探究COX-2抑制劑對MSCs輻射損傷的影響,以及COX-2抑制劑對輻射所致小鼠組織損傷的影響。為抗輻射防護劑的研發(fā)提供新的思路和理論依據(jù);同時,為臨床合理用藥提供基礎(chǔ)理論參考。
方法:
1.小鼠結(jié)腸MSCs分離、培養(yǎng)
通過兩步消化法,從C57BL/6小鼠結(jié)腸組織中分離出MSCs,并在低糖培養(yǎng)基中進行體外培養(yǎng)。
2、> 2.細胞鑒定
顯微觀察細胞生長狀態(tài)及形態(tài)特征;采用流式細胞術(shù)(fluorescence activated cellsorting,F(xiàn)ACS)檢測細胞表型;采用免疫細胞化學(xué)(immunocytochemistry,ICC)、蛋白免疫印跡(western blot,WB)以及FACS技術(shù)檢測細胞COX-2表達;CCK-8法檢測細胞增殖活性;利用體外誘導(dǎo)分化技術(shù),分析細胞分化潛能;同時,采用Real-timePCR技術(shù)對細胞
3、的干性相關(guān)基因進行初步檢測分析。
3.藥物濃度篩選
用不同濃度梯度的阿司匹林和塞來昔布預(yù)處理體外培養(yǎng)的小鼠結(jié)腸組織間充質(zhì)干細胞(colonic mesenchymal stem cells,cMSCs),24 h后采用CCK-8法檢測細胞活性,篩選合理的藥物濃度用于后續(xù)的細胞實驗。
4.COX-2抑制劑對小鼠cMSCs中COX-2表達的影響
用篩選得到的合理劑量的阿司匹林和塞來昔布預(yù)處理cMSCs
4、,分別于24 h和48h后,采用WB技術(shù)對各處理組COX-2表達進行檢測分析。
5.建立細胞輻照模型
(1)不同劑量電離輻射對cMSCs增殖活性的影響
用不同劑量的60Co-γ射線刺激cMSCs,輻照后24 h,采用CCK-8法檢測各處理組細胞增殖活性,篩選合理的輻照劑量用于后續(xù)細胞實驗。
(2)輻照后,不同時間點cMSCs增殖活性改變
用篩選得到的合適的輻照劑量刺激小鼠cMSCs,分別
5、于輻照后6、24、48和72h,采用CCK-8法檢測各組細胞增殖活性,篩選合理的檢測時間點用于后續(xù)的細胞實驗研究。
6.COX-2抑制劑對cMSCs輻射損傷的影響
用阿司匹林(75μmol/L)和塞來昔布(20μmol/L)預(yù)處理小鼠cMSCs,24 h后給予細胞15 Gy60Co-γ射線輻照刺激,輻照后24 h,采用CCK-8法對各處理組細胞增殖活性進行檢測分析。
7.COX-2抑制劑對輻射后小鼠組織的影
6、響
分別對小鼠進行灌胃給藥2w,同時采用60Co-γ射線對小鼠進行全身輻照處理,并對各處理組動物組織損傷改變進行觀察分析。
結(jié)果:
一、小鼠cMSCs分離培養(yǎng)與鑒定
1.細胞基本特征
經(jīng)顯微觀察發(fā)現(xiàn),細胞呈貼壁狀態(tài)生長,細胞形態(tài)為成纖維細胞狀,且傳代培養(yǎng)后細胞形態(tài)不發(fā)生改變。
2.所分離培養(yǎng)的小鼠結(jié)腸間充質(zhì)細胞表達CD29和CD44表型分子
流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,培
7、養(yǎng)到第三代的小鼠結(jié)腸間充質(zhì)細胞高表達CD29和CD44兩種常見的間充質(zhì)干細胞表面標(biāo)志物,其中,CD29分子陽性的細胞占(97.48±1.18)%,CD44分子陽性的細胞達到(91.18±1.97)%。
3.所分離培養(yǎng)的細胞具有一定的增殖能力
采用CCK-8法對培養(yǎng)三代以后的小鼠結(jié)腸間充質(zhì)細胞的增殖活性進行檢測,結(jié)果顯示,隨著培養(yǎng)時間的延長,細胞增殖呈上升趨勢。
4.所分離培養(yǎng)的小鼠結(jié)腸間充質(zhì)細胞具有一定的分
8、化能力
對培養(yǎng)三代以后的小鼠結(jié)腸間充質(zhì)細胞進行誘導(dǎo)分化培養(yǎng),結(jié)果顯示,經(jīng)一段時間培養(yǎng)后,該細胞可分化為成骨細胞和脂肪細胞。
5.所分離培養(yǎng)的小鼠結(jié)腸間充質(zhì)細胞可表達Bmi1和Lrig1干性基因
采用Real-time PCR技術(shù)對細胞干性基因進行分析,結(jié)果顯示,該細胞可能表達Bmi1和Lrig1干性基因。
6.所分離培養(yǎng)的小鼠cMSCs表達COX-2
ICC、WB以及FACS檢測結(jié)果顯示
9、,cMSCs表達COX-2。
二、阿司匹林和塞來昔布對正常體外培養(yǎng)的小鼠cMSCs的影響
1.不同濃度阿司匹林和塞來昔布對正常體外培養(yǎng)的小鼠cMSCs細胞活性的影響
CCK-8結(jié)果顯示,阿司匹林在最高濃度為100μM的范圍內(nèi)沒有對cMSCs產(chǎn)生明顯的細胞毒性作用(P=1.000);與正常未給藥組相比,20μM塞來昔布給藥組的細胞活力未出現(xiàn)明顯改變[(94.58±7.04)%vs(100.00±6.01)%,
10、P=1.000]。
2.阿司匹林和塞來昔布對細胞COX-2表達的影響
WB檢測結(jié)果顯示,75μM阿司匹林和20μM塞來昔布預(yù)處理后,cMSCs中COX-2表達未出現(xiàn)明顯改變。
三、鈷60-γ射線輻照對體外培養(yǎng)的小鼠cMSCs的影響
1.不同劑量鈷60-γ射線輻照對cMSCs的影響
CCK-8檢測結(jié)果顯示,鈷60-γ射線對cMSCs具有一定的增殖抑制作用。與正常對照組相比,15Gy輻照組細
11、胞增殖率顯著降低[(86.98±6.61)%vs(100.00±4.53)%,P<0.01]。
2.輻照后,不同時間點小鼠cMSCs損傷改變
CCK-8檢測結(jié)果顯示,與正常對照組相比,輻照后6 h cMSCs增殖活性未發(fā)生明顯改變[(95.62±4.57)%vs(100.00±1.53)%,P>0.05];但是24 h后細胞增殖率顯著下降[(89.90±2.16)%vs(100.00±1.53)%,P<0.01],然
12、而,隨著時間的繼續(xù)延長,細胞增殖未出現(xiàn)明顯的進一步下降趨勢(P>0.05)。
四、 COX-2抑制劑對cMSCs輻射損傷的影響
CCK-8檢測結(jié)果顯示,與正常對照組相比,輻照后,體外培養(yǎng)的小鼠cMSCs細胞增殖顯著抑制[(90.22±1.70)%vs(100.00±5.37)%,P=0.012];給予阿司匹林預(yù)處理后,細胞輻射損傷未出現(xiàn)明顯加重[(86.67±4.94)%vs(90.22±1.70)%,P=0.321
13、];但是,與輻照組相比,輻照+塞來昔布組細胞增殖顯著降低[(80.86±0.96)%vs(90.22±1.70)%,P=0.025]。
五、 COX-2抑制劑對輻射后小鼠腸道的影響
HE染色結(jié)果顯示,全身輻照后,各處理組小鼠腸組織病理未見明顯差異;TUNEL染色結(jié)果顯示,給處理組之間腸組織細胞凋亡沒有出現(xiàn)明顯改變。同時,輻照后,各處理組小鼠腸組織隱窩生存情況亦未見明顯改變。提示所給劑量的阿司匹林和塞來昔布未加重輻射后
14、小鼠腸道損傷。
六、 COX-2抑制劑對輻射后小鼠胸腺和脾臟的影響
與對照組相比,低劑量(4 Gy)輻照組小鼠的胸腺臟器系數(shù)在輻照后3.5 d顯著降低[(34.11±5.74)%vs(100.00±16.37)%,P<0.01],提示胸腺損傷;同時,輻照后,小鼠出現(xiàn)明顯的脾損傷,主要表現(xiàn)為脾臟器系數(shù)下降[(35.30±4.71)% vs(100.00±10.30)%,P<0.01]。
與低劑量輻照組相比,高
15、劑量(8Gy)輻照組小鼠的胸腺臟器系數(shù)在5.5 d時降低幅度更大[(13.19±1.96)%vs(40.40±13.46)%],但兩種輻照劑量組之間脾臟器系數(shù)在5.5 d時降低程度相近[(30.28±1.13)%vs(31.20±1.17)%];高劑量輻照后第7d,輻照組小鼠胸腺臟器系數(shù)較5.5 d時有所升高[(34.03±8.40)%vs(13.19±1.95)%],此外,脾臟器系數(shù)亦有所升高[(37.32±2.10)%vs(30.2
16、8±1.13)%]。
與對照組相比,藥物預(yù)處理后,小鼠胸腺和脾臟器系數(shù)均未顯著降低。
七、 COX-2抑制劑對輻射后小鼠骨髓的影響
HE染色結(jié)果顯示,全身輻照后,小鼠出現(xiàn)明顯的骨髓抑制。與對照組相比,輻照組小鼠骨髓中細胞明顯減少,同時空泡明顯增多;進一步的TUNEL染色結(jié)果顯示,輻照后C57BL/6小鼠骨髓中凋亡細胞顯著增多。
與對照組相比,藥物預(yù)處理組小鼠骨髓組織并未發(fā)生明顯的病理損傷改變。
17、r> 結(jié)論:
1.我們成功建立了腸組織MSCs體外分離培養(yǎng)方法;
2.小鼠cMSCs表達COX-2;
3.鈷60-γ射線可造成cMSCs損傷;
4.COX-2選擇性抑制劑塞來昔布可加重cMSCs輻射損傷;
5.阿司匹林(15mg/kg/d)和塞來昔布(60mg/kg/d)對正常C57BL/6小鼠的胸腺、脾臟、骨髓和腸組織無明顯的損傷作用;
6.鈷60-γ射線(4、8Gy)全身
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