2BFI對(duì)EAE小鼠淋巴細(xì)胞亞群的免疫調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的:雖然本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)證實(shí)咪唑啉-2受體(I2R)特異性配體2BFI對(duì)小鼠多發(fā)性硬化模型實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmuneencephalomyelitis，EAE)的發(fā)生有保護(hù)作用，但是機(jī)制未明。本研究主要觀察2BFI整體實(shí)驗(yàn)干預(yù)下對(duì)EAE小鼠中樞和外周的淋巴細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的變化，從而探討2BFI對(duì)EAE干預(yù)作用的細(xì)胞免疫學(xué)機(jī)制。
　　方法與內(nèi)容: SPF級(jí)C57BL/6小鼠:雌性，

2、6-8周齡，體重14～16g。用MOG35-55免疫C57BL/6小鼠制作EAE模型，將小鼠隨機(jī)分為3組:CFA對(duì)照組(CFA-controlgroup)，EAE模型對(duì)照(EAE-control group)組，2BFI藥物干預(yù)組(EAE-2BFI20 mg·kg-1group)。EAE對(duì)照組2BFI干預(yù)組小鼠用MOG35-55混合CFA制成抗原乳劑皮內(nèi)注射，CFA對(duì)照組以生理鹽水代替抗原肽制備抗原乳劑皮內(nèi)注射，0、48小時(shí)腹腔注射PT

3、造模。2BFI干預(yù)組于免疫當(dāng)天開(kāi)始腹腔注射給藥，每天兩次，連續(xù)14天。CFA對(duì)照組和EAE對(duì)照組組腹腔注射生理鹽水(NS)代替。自免疫當(dāng)日定為第0天，每日兩次觀察并記錄動(dòng)物行為學(xué)及體重的變化。采用量化評(píng)分法，比較不同組別的EAE發(fā)病率、潛伏期、癥狀評(píng)分。CFA對(duì)照組于20天處死，其他各組動(dòng)物于發(fā)病高峰期處死。取神經(jīng)組織（腰髓）用多聚甲醛固定，行HE染色觀察評(píng)價(jià)組織炎癥病理變化;用流式細(xì)胞檢測(cè)術(shù)(FCM)分析中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)及脾臟C

4、D4+T、CD8+T、CD4+TCD25+Treg、B cell及CD39的變化。用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-pcr)法測(cè)定小鼠大腦干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)、白介素-10(interleukin-10，IL-10)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factorβ，TGF-β) mRNA的表達(dá)

5、。
　　結(jié)果:
　　1、發(fā)病率和行為學(xué)變化:EAE對(duì)照組小鼠最早發(fā)病于免疫后第13天(13dpi)。各組動(dòng)物EAE誘發(fā)率分別為CFA(0/8)，EAE(8/8)，EAE-2BFI(3/8)，提示2BFI干預(yù)后EAE誘發(fā)率呈下降趨勢(shì)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05)。2BFI藥物干預(yù)組的最大臨床癥狀評(píng)分平均值(2.88±1.44)較EAE對(duì)照組(9.44±0.53)明顯降低(P＜0.01)。發(fā)病小鼠表現(xiàn)為活動(dòng)減少、進(jìn)食減少、體重減

6、輕，先出現(xiàn)尾張力降低、尾巴拖地不能抬起，繼而步態(tài)異常、后肢無(wú)力、癱瘓。CFA對(duì)照組小鼠未見(jiàn)發(fā)病，體重呈現(xiàn)緩慢上升。
　　2、病理學(xué)改變:CFA對(duì)照組小鼠脊髓的組織病理學(xué)檢查所見(jiàn)H.E.染色正常。EAE對(duì)照組小鼠可見(jiàn)脊髓內(nèi)彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)及大量的炎性病灶，病灶處小血管管周有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，成“血管袖套樣改變”。2BFI干預(yù)組小鼠腦脊髓炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。組織損害病理（異常）發(fā)生率較EAE對(duì)照組降低（P＜0.05），炎癥病理評(píng)

7、分較EAE對(duì)照組降低（P＜0.05)。
　　3、流式細(xì)胞檢測(cè)淋巴細(xì)胞亞群變化的結(jié)果:①外周淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)的結(jié)果:與CFA對(duì)照組相比，EAE對(duì)照組和2BFI藥物干預(yù)組小鼠外周CD4+T、CD8+T均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而EAE對(duì)照組與2BFI干預(yù)組比較差別不大。而此兩組CD4+TCD25+Treg、B cell、CD39較CFA對(duì)照組均明顯增加（P＜0.05)，其中B cell在2BFI干預(yù)組的表達(dá)低于EAE對(duì)

8、照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。
　　②中樞各淋巴細(xì)胞亞群變化的比較:CFA對(duì)照組小鼠中樞未檢測(cè)到淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，2BFI藥物干預(yù)組小鼠中樞CD4+T、CD8+T、CD4+TCD25+Treg的表達(dá)較EAE對(duì)照組降低，其中CD4+T、CD4+TCD25+Treg的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），B cell、CD39的表達(dá)較EAE對(duì)照組增加且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)。
　　4、RT-PCR檢測(cè)炎癥細(xì)胞因子的變化

9、:與CFA對(duì)照組比較，EAE對(duì)照組小鼠CNS內(nèi)表達(dá)IFN-γmRNA的水平明顯增加;與EAE對(duì)照組比較，2BFI干預(yù)組小鼠CNS內(nèi)IFN-γmRNA水平均降低(P＜0.05)，而TGF-β、IL-10mRNA水平均升高（P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、本實(shí)驗(yàn)中，EAE發(fā)病小鼠臨床癥狀與文獻(xiàn)報(bào)道相似，中樞病理學(xué)檢測(cè)有彌漫性淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，F(xiàn)CM檢測(cè)證實(shí)EAE致病過(guò)程中有CD4+T、CD8+T浸潤(rùn)，而且B cell、CD39

10、、CD4+TCD25+Treg及相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ、TGF-β、IL-10均參與調(diào)控EAE發(fā)病，證明實(shí)驗(yàn)所制作的小鼠EAE的模型是成功的，符合要求的。
　　2、2BFI干預(yù)對(duì)EAE小鼠具有明顯保護(hù)作用，主要表現(xiàn)在2BFI干預(yù)組小鼠發(fā)病率降低，臨床癥狀和病理組織學(xué)損傷程度減輕。
　　3、2BFI能抑制EAE過(guò)程中外周活化的T淋巴細(xì)胞進(jìn)入CNS，抑制致病性CD4+T、CD8+T在中樞的表達(dá)，上調(diào)與EAE恢復(fù)相關(guān)的B cell