5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)脂多糖激活的巨噬細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的:
　　 1.研究不同濃度5-氟尿嘧啶(5-FU)對(duì)脂多糖(LPS)激活的SD大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)的抑制作用;
　　 2.研究Bcl-2（B淋巴細(xì)胞瘤-2）、Bax（Bcl-2相關(guān)X蛋白）mRNA及蛋白表達(dá)及Caspase-3（半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3）活性、蛋白表達(dá)在不同濃度5-FU作用于受LPS激活的巨噬細(xì)胞的表達(dá)量變化;
　　 3.研究5-FU對(duì)LPS激活的巨噬細(xì)胞凋亡作用與P53通路關(guān)系，探

2、討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.自SD大鼠腹腔提取巨噬細(xì)胞，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)、瑞氏染色做細(xì)胞鑒定及臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定其活力;LPS(1μg/ml)刺激大鼠巨噬細(xì)胞建立體外炎癥模型;
　　 2.設(shè)置空白對(duì)照組、LPS（1μg/ml）組、LPS+5-FU(0.01、0.1、0.5、1、5、10mM)組，共同孵育24小時(shí)。采用細(xì)胞計(jì)數(shù)CCK8試劑盒(CCK8)檢測(cè)細(xì)胞活性。
　　 3.設(shè)置空白對(duì)

3、照組、LPS組、5-FU（0.5mM）組、LPS+5-FU(0.5mM)組，孵育12h后，經(jīng)Hoechst染色后，熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)4.設(shè)立空白對(duì)照組、LPS組及LPS+5-FU（0.1、0.5、1、5mM）組，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)分別12h、8h、6h后，采用Caspase-3活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各時(shí)間段Caspase-3的活力。
　　 5.設(shè)空白對(duì)照組、LPS組及LPS+5-FU(0.1、0.5、1、5mM)組，培養(yǎng)12h

4、后Trizol法提取總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Realtime-PCR)檢測(cè)Bcl-2、Bax及P53基因的表達(dá)。
　　 6.設(shè)空白對(duì)照組、LPS組及LPS+5-FU(0.1、0.5、1、5mM)組，培養(yǎng)12h后，蛋白質(zhì)印跡(Western blot，WB)測(cè)定Bcl-2、Bax、p-Caspase-3（磷酸化Caspase-3）及P53/p-P53（磷酸化P53）蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.細(xì)胞形態(tài)

5、觀察及鑒定結(jié)果:倒置顯微鏡下，巨噬細(xì)胞狀態(tài)良好可見較多細(xì)胞偽足，細(xì)胞呈圓形或橢圓形。瑞氏染色可見巨噬細(xì)胞胞核呈紫紅色，胞核形態(tài)多樣，呈卵圓形、腎形或馬蹄形，核常偏位;胞漿呈藍(lán)紫色或細(xì)小淡紅色。臺(tái)盼藍(lán)染色顯示其活力＞95％。
　　 2.CCK-8檢測(cè)結(jié)果:顯示與LPS組相比，不同濃度5-FU對(duì)受LPS刺激的巨噬細(xì)胞有明顯的促凋亡作用。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而且不同濃度5-FU作用于未經(jīng)LPS刺激的巨噬細(xì)胞時(shí)，比受LPS激活的巨噬細(xì)胞

6、表現(xiàn)出一定的抵抗力，其組內(nèi)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.Hoechst染色結(jié)果:染色結(jié)果可見LPS組細(xì)胞凋亡多于空白對(duì)照組，LPS+5-FU(0.5mM)組凋亡細(xì)胞明顯多于LPS組，而相比于空白對(duì)照組，5-FU(0.5mM)組細(xì)胞凋亡未見明顯增加。
　　 4.Caspase-3活性變化:不同時(shí)間下不同濃度下呈不同的趨勢(shì)，在6h組顯示隨5-FU的濃度增加而出現(xiàn)上升趨勢(shì);且6h組顯示，與LPS組相比，5-FU可增加LPS刺

7、激的巨噬細(xì)胞的凋亡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.Bcl-2、Bax及P53mRNA表達(dá):受LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞在不同濃度的5-FU作用24h下Bcl-2mRNA表達(dá)呈濃度依賴性降低趨勢(shì)，而Bax mRNA及P53mRNA表達(dá)呈濃度依賴性升高，與LPS組相比，各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6.Bcl-2、Bax、p-Caspase-3及P53/pP53蛋白表達(dá):WB結(jié)果顯示，6h組p-Caspase-3蛋白表達(dá)隨濃度

8、增加而增加，與LPS組相比，各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。受LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞在不同濃度的5-FU作用下Bcl-2蛋白表達(dá)呈濃度依賴性降低趨勢(shì)，Bax、P53及pP53蛋白表達(dá)則呈濃度依賴性上升趨勢(shì)，與LPS組相比，各組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功建立實(shí)驗(yàn)需要的體外炎癥實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?br>　　 2.5-FU能有效的誘導(dǎo)LPS激活的大鼠巨噬細(xì)胞凋亡，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。
　　 3.5-FU誘導(dǎo)