CP-25聯(lián)合5-氟尿嘧啶抗肝細(xì)胞癌的作用.pdf

1、肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）流行性評(píng)估報(bào)告GLOBOCAN2012（Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in2012）顯示，肝癌發(fā)生率在癌癥中排第六位，死亡率排第二位，且男性發(fā)病率明顯高于女性。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是肝癌的最主要類型，其具有轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，惡性程度高，預(yù)后較差等

2、特點(diǎn)。HCC的治療手段較多（包括手術(shù)、放療、化療、肝臟移植等），其中手術(shù)是HCC治療的最重要手段。但由于HCC發(fā)病隱匿，多數(shù)患者被確診時(shí)即為晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳的手術(shù)時(shí)期?；瘜W(xué)治療是當(dāng)前除手術(shù)切除外最主要的HCC治療手段，然而化療藥物選擇性差、易耐藥且毒副作用大的缺點(diǎn)，導(dǎo)致其治療效果不如人意。因此，尋求新的安全有效的抗HCC化療藥物顯得尤為重要。
　　CP-25是一種新型活性單體藥物-苯磺酰芍藥苷（芍藥苷-6-氧-苯磺酸酯），是由我們

3、所通過(guò)對(duì)天然藥物白芍中的活性單體芍藥苷（Pаe）進(jìn)行酯化修飾后得到的單體化合物，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用。然而CP-25是否具有抗HCC的作用，尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，CP-25可抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721的增殖和肝癌H22細(xì)胞移植瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。由此我們推測(cè)，CP-25具有一定的抗HCC作用。但初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單用CP-25抗HCC作用較弱，可能與臨床使用的化療藥物細(xì)胞毒性作用不同。5-FU是目前臨床最常用

4、的抗消化道腫瘤藥物，單用5-氟尿嘧啶對(duì)HCC有確定的治療作用，但毒副作用較大，常見(jiàn)有胃腸道反應(yīng)、脫發(fā)以及骨髓抑制等。目前研究發(fā)現(xiàn)，部分抗癌藥物進(jìn)行聯(lián)合具有協(xié)同抗癌作用，主要的毒副作用不重疊，所以具有高效和低毒的特點(diǎn)。通過(guò)閱讀文獻(xiàn)和前期實(shí)驗(yàn)推測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)CP-25和5-FU在部分機(jī)制上有著相似重合的可能性。因此，本課題在以往研究的基礎(chǔ)上，采用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法，探究CP-25聯(lián)合5-FU抗HCC的作用及其部分可能的作用機(jī)制。

5、>　　目的：
　　探究CP-25聯(lián)合5-FU抗HCC的作用及其部分可能的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1將50只兩周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、CP-25組(70 mg·kg-1)、5-FU組(5-FU，20 mg·kg-1)和CP-25+5-FU組（CP-25，70 mg·kg-1；5-FU，20 mg·kg-1），共5組，每組10只。除正常組外，其他各組小鼠一次性腹腔注射DEN溶液20 mg·k

6、g–1，正常組小鼠腹腔注射等體積的溶媒。第16 w開(kāi)始，給藥組按CP-25灌胃（1次/d，6次/w）、5-FU腹腔注射（1次/3d，2次/w）方式給予小鼠體內(nèi)，連續(xù)給藥8 w，正常組及模型組給予等量的溶媒。第44 w眼球放血處死小鼠，摘取肝臟、脾臟、肺等臟器，稱量小鼠各臟器重量，計(jì)數(shù)肝臟表面腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和體積；HE染色觀察肝臟組織病理學(xué)變化；賴氏法檢測(cè)血清中ALT，ALP，AST水平；ELISA法檢測(cè)血清中AFP水平。Western bl

7、ot、免疫組化法檢測(cè)肝臟中P53，Bax，Bcl-2，Caspase-9，Cytochrome c，MMP-2，MMP-9蛋白表達(dá)水平。
　　2選取肝癌細(xì)胞株HepG2和Bel-7402，分別將CP-25、5-FU、CP-25+5-FU加入HepG2和Bel-7402細(xì)胞培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24、48 h。CCK-8檢測(cè)CP-25聯(lián)合5-FU對(duì)HepG2和Bel-7402的生長(zhǎng)抑制作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)HepG2和Bel-7402凋亡的

8、影響；劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell等檢測(cè)對(duì)Bel-7402侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響。Western-blot法檢測(cè)HepG2和Bel-7402中P53，Bax，Bcl-2，Caspase-9，Cytochrome c以及Bel-7402中MMP-2，MMP-9蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1. CP-25聯(lián)合5-FU對(duì)DEN誘導(dǎo)HCC小鼠的治療作用
　　1.1對(duì)DEN誘導(dǎo)的HCC小鼠腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和結(jié)節(jié)體積的影響
　　

9、肝臟圖片顯示，正常組小鼠肝臟表面圓潤(rùn)、光滑、無(wú)結(jié)節(jié)形成；模型組小鼠肝臟表面粗糙、凹凸不平，有明顯的腫瘤結(jié)節(jié)形成。與模型組相比，CP-25組、5-FU組及CP-25+5-FU組均能明顯減少肝臟表面結(jié)節(jié)數(shù)、減小腫瘤結(jié)節(jié)體積；與單獨(dú)用藥組（CP-25組、5-FU組）相比，CP-25+5-FU組肝臟表面結(jié)節(jié)數(shù)明顯減少。
　　1.2對(duì)DEN誘導(dǎo)的HCC小鼠肝臟指數(shù)、脾指數(shù)的影響
　　SPASS分析結(jié)果表明，模型組小鼠肝臟、脾指數(shù)明顯高

10、于正常組。與模型組相比，CP-25、5-FU及CP-25+5-FU均能顯著降低DEN誘導(dǎo)的HCC小鼠升高的肝臟、脾臟指數(shù)。而CP-25+5-FU組與5-FU組相比，脾臟指數(shù)顯著降低，肝臟指數(shù)無(wú)顯著性差異。
　　1.3 CP-25聯(lián)合5-FU顯著改善DEN誘導(dǎo)的肝組織病理?yè)p傷
　　HE病理圖片顯示，正常組小鼠肝組織細(xì)胞核清晰，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞索排列整齊；模型組小鼠肝細(xì)胞大小、形態(tài)各異，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，形成大量假小葉和炎性

11、細(xì)胞浸潤(rùn)；CP-25組、5-FU組及CP-25+5-FU組均可明顯改善肝臟損傷，減輕炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和假小葉形成；而CP-25+5-FU組與CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組相比，能明顯改善肝臟的病理?yè)p傷。
　　1.4 CP-25聯(lián)合5-FU顯著降低DEN誘導(dǎo)升高的血清AST，ALT，ALP，AFP水平
　　模型組小鼠血清中AST，ALP，ALT，AFP水平均明顯高于正常組。CP-25組、5-FU組及CP-25+5-FU組小鼠血清A

12、LT，AST，ALP，AFP水平均明顯低于模型組。CP-25+5-FU組與CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組相比，小鼠血清ALT，AST，ALP，AFP水平明顯降低。
　　1.5對(duì)DEN誘導(dǎo)HCC小鼠肝組織中P53，Bax，Bcl-2，Cytochrome c，Caspase-9，MMP-2，MMP-9蛋白表達(dá)的影響
　　與正常組相比，模型組小鼠肝組織中P53，Bax，Cytochromec，Caspase-9表達(dá)明顯降低，Bc

13、l-2，MMP-2，MMP-9表達(dá)顯著升高。CP-25組、5-FU組、CP-25+5-FU組小鼠肝組織中P53，Bax，Cytochrome c，Caspase-9表達(dá)明顯高于模型組，而B(niǎo)cl-2，MMP-2，MMP-9水平明顯低于模型組。CP-25+5-FU組升高P53，Bax，Cytochrome c，Caspase-9表達(dá)，降低Bcl-2，MMP-2，MMP-9的作用強(qiáng)于CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組。
　　2 CP-25聯(lián)

14、合5-FU對(duì)HCC細(xì)胞HepG2和Bel-7402的作用
　　2.1對(duì)HepG2和Bel-7402生長(zhǎng)的影響
　　與未加藥組相比，CP-25組、5-FU組及CP-25+5-FU組對(duì)均明顯抑制HepG2和Bel-7402的存活率，且CP-25+5-FU組細(xì)胞存活率低于CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組。
　　2.2對(duì)HepG2和Bel-7402凋亡的影響
　　FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率顯示，與未加藥組相比，CP-25組、5-

15、FU組及CP-25+5-FU組對(duì)均明顯促進(jìn)HepG2和Bel-7402凋亡；CP-25+5-FU組處理HepG2，Bel-7402細(xì)胞48 h后，其凋亡率明顯高于CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組。
　　2.3對(duì)Bel-7402侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響
　　CP-25聯(lián)合5-FU作用Bel-7402細(xì)胞24 h后，與未加藥組相比，CP-25組細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力明顯降低，而5-FU組對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力有抑制作用，但無(wú)顯著性差異；

16、與CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組相比，CP-25+5-FU組可明顯抑制肝癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的能力。
　　2.4對(duì)HepG2和Bel-7402中P53，Bax，Bcl-2，Caspase-9，Cytochrome c，MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的影響。
　　Western blot結(jié)果顯示，與未加藥組相比，CP-25組、5-FU組及CP-25+5-FU組細(xì)胞中 P53，Bax，Cytochrome c，Caspase-9表達(dá)

17、明顯升高，Bcl-2，MMP-2，MMP-9表達(dá)顯著降低。CP-25+5-FU組細(xì)胞中Bax，活化的P53，Caspase-9和Cyt c表達(dá)明顯高于CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組，Bcl-2，MMP-2，MMP-9表達(dá)顯著低于CP-25、5-FU單獨(dú)用藥組。
　　結(jié)論：
　　1. CP-25聯(lián)合5-FU可抑制DEN誘導(dǎo)的小鼠HCC的發(fā)生和發(fā)展，具有一定的抗HCC作用。
　　2. CP-25聯(lián)合5-FU可誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞H