5-氟尿嘧啶聯(lián)合白藜蘆醇的抗腫瘤作用研究.pdf

1、在發(fā)展中國家，癌癥是僅次于心臟疾病的死亡率最高的疾病，隨著生存環(huán)境的惡化，人口增長與老齡化，環(huán)境污染以及與癌癥有關(guān)的生活方式的改變（如吸煙、運動減少以及更多地采取西化飲食結(jié)構(gòu)），癌癥的發(fā)生率逐年增加。目前惡性腫瘤的治療方法包括手術(shù)、放療、化療和免疫治療等手段，以化學治療為主的綜合治療在其中占有十分重要的地位。化學治療指的是使用化學藥物殺滅腫瘤細胞，理想的化療藥物應(yīng)該是通過抑制細胞生長或細胞毒作用，只針對腫瘤細胞特異性殺傷而不影響正常細胞

2、。但事實上，臨床常用的化療藥物其腫瘤抑制作用大多與劑量相關(guān)，在殺傷腫瘤細胞的同時具有細胞毒作用的無選擇性，從而對宿主全身會產(chǎn)生毒副作用，成為化療實施的障礙，從而在很大程度上影響腫瘤治療的效果。因此，除了尋找高效低毒的新化療藥物以外，還可以通過與其他化合物或藥物聯(lián)合產(chǎn)生相加或協(xié)同作用以提高化療效果。如能改變腫瘤細胞的周期進程，使大量腫瘤細胞暫時性蓄積在某一時相，同時應(yīng)用細胞周期特異性藥物殺傷處于此藥物敏感時相的腫瘤細胞將能明顯提高治療效果

3、，同時也可降低化療藥物劑量從而減輕不良反應(yīng)，這樣的研究將具有重要意義。
　　 5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil，5-Fu)是常見的化療藥物，常用于實體瘤的治療，可以通過將細胞周期阻滯于G1/S期并干擾細胞基本生物合成過程誘導腫瘤細胞的凋亡從而起到抑制腫瘤生長的作用。5-Fu還可以作為胸苷酸合成酶(TS)的抑制劑摻入DNA和RNA結(jié)構(gòu)中使腫瘤細胞無法正常合成DNA，影響其正常功能。鑒于5-Fu的作用機理，它在治療過程中也

4、會影響正常細胞的功能而產(chǎn)生毒副作用，另外，目前比較常見的5-Fu使用中產(chǎn)生的抗藥性也成了阻礙其發(fā)揮療效的障礙?，F(xiàn)在已有很多二線藥物如紫杉醇、絲裂霉素、四氫葉酸、喃氟啶等開始與5-Fu聯(lián)合使用，其目的是在保持其抗腫瘤作用最大化的同時減少5-Fu的毒副作用。除了這些藥物以外，一些天然植物素也能達到對5-Fu增效減毒的效果。
　　 白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種廣泛存在于自然界中的植物抗毒素，是植物對抗外界環(huán)境壓力如

5、氣候變化，暴露于更多的臭氧環(huán)境中，日曬和重金屬刺激以及病原微生物感染等情況時所產(chǎn)生的。大量研究結(jié)果顯示白藜蘆醇可以對抗多種疾病甚至癌癥。研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對腫瘤的起始、促進和發(fā)展三個階段均有抑制作用，可作為天然的腫瘤化學預(yù)防劑。其抗腫瘤作用可能與其影響細胞生長、抗炎、誘導細胞凋亡和抗侵襲能力有關(guān)。白藜蘆醇可以影響體內(nèi)多種基因表達，其中包括腫瘤抑制因子p53和Rb，細胞周期調(diào)節(jié)蛋白Cyclin家族以及多種凋亡調(diào)節(jié)因子。諸多的體內(nèi)外研究證實白

6、藜蘆醇可以作為抗腫瘤藥物或與其他化療藥物聯(lián)合使用治療一些有抗藥性的癌癥。
　　 皮膚癌尤其是非黑色素性皮癌(NMSC)是世界上發(fā)病數(shù)量最多的人類腫瘤，近年來的發(fā)病率日益升高，據(jù)估計每年新增病例超過一百萬。如此高的年發(fā)病率使其越發(fā)受到公眾的關(guān)注。食管癌的死亡率很高，在世界惡性腫瘤死亡率中占據(jù)第六位，而我國正是是食管癌的高發(fā)地區(qū)。鑒于這兩種腫瘤的高發(fā)性，本實驗中選取食管鱗狀細胞癌株TE-1、人表皮癌A431細胞株作為研究對象來考察5

7、-Fu與白藜蘆醇聯(lián)合在細胞生長、細胞周期和凋亡方面的作用，并對可能與聯(lián)合作用有關(guān)的凋亡通路進行了研究。實驗共分為四部分：
　　 第一部分5-氟尿嘧啶聯(lián)合白藜蘆醇對腫瘤細胞A431、TE-1生長的抑制和細胞毒作用
　　 目的：研究5-Fu聯(lián)合白藜蘆醇對腫瘤細胞A431、TE-1生長的抑制作用和致壞死能力
　　 方法：本部分實驗中采用MTT法、生長曲線實驗、平板克隆實驗對5-Fu和白藜蘆醇的聯(lián)合用藥進行評價，聯(lián)合用藥

8、的效果采用Chou-Talalay法進行定量評價分析。細胞毒作用采用LDH溢出實驗進行評價。
　　 結(jié)果：(1)MTT實驗顯示5-Fu有抑制腫瘤細胞的生長的能力，而且這種作用呈時間與濃度依賴性。而白藜蘆醇在較高濃度(不低于10μmol/L)才能夠產(chǎn)生抑制作用。二者聯(lián)合使用時在很大的濃度范圍內(nèi)都可以產(chǎn)生協(xié)同作用(白藜蘆醇不低于10μmol/L)。聯(lián)合用藥可以大大降低5-Fu或白藜蘆醇對A431的中效濃度(5-Fu的IC50從單獨使

9、用時的322.89μM降至71.99μM;白藜蘆醇的IC50從174.58μM降至37.56μM)。對TE-1聯(lián)合用藥可以分別將5-Fu的IC50從480.83μM降至151.87μM，而白藜蘆醇的IC50可從248.64μM降至69.42μM。該結(jié)果顯示5-Fu和白藜蘆醇聯(lián)合使用可在很大程度上減少各藥物的用量。
　　 采用Chou-Talalay法對5-Fu和白藜蘆醇的聯(lián)合作用48h的效應(yīng)進行評價，當兩藥聯(lián)合使用對腫瘤的的抑制

10、效應(yīng)達到50％時，A431細胞的聯(lián)合指數(shù)CI為0.438，而對TE-1的聯(lián)合指數(shù)CI為0.595。二者聯(lián)合在高于0.2的效應(yīng)范圍內(nèi)CI值均不高于1，說明在一個很大的效應(yīng)范圍內(nèi)(0.2-0.95)5-Fu聯(lián)合白藜蘆醇都能產(chǎn)生協(xié)同作用。(2)生長曲線實驗結(jié)果顯示，當5-Fu和白藜蘆醇單獨使用時都能對腫瘤細胞的生長起到抑制作用，當二者聯(lián)合使用時對腫瘤細胞的生長曲線抑制更為明顯，與對照組和各單藥組相比均存在顯著性差異。(3)平板克隆實驗結(jié)果顯示

11、14天后A431和TE-1各自有17.60％和26.75％的克隆形成率，白藜蘆醇單獨使用可以使兩種細胞的克隆形成率分別降至A4315.42％，TE-110.13％。而5-Fu單獨使用的克隆形成率分別為A4311.07％，TE-12.23％。兩種細胞的聯(lián)合用藥組則幾乎沒有克隆形成，各組間在統(tǒng)計學上表現(xiàn)為極顯著性差異。(4)LDH活性實驗顯示了5-Fu和白藜蘆醇單獨使用所導致的A431和TE-1細胞壞死分別出現(xiàn)在48h和72h后，而聯(lián)合給藥

12、組在24h即出現(xiàn)LDH的溢出，說明聯(lián)合用藥對腫瘤細胞的抑制作用可能與壞死有一定關(guān)系，而且其程度均高于各單獨用藥組。
　　 結(jié)論：(1)5-Fu和白藜蘆醇都可以對細胞產(chǎn)生時間依賴和濃度依賴性抑制，聯(lián)合用藥組在大部分效應(yīng)范圍內(nèi)都表現(xiàn)為協(xié)同作用。(2)5-Fu和白藜蘆醇聯(lián)合或單獨使用都會對A431和TE-1的生長曲線產(chǎn)生抑制作用，聯(lián)合用藥與單獨用藥相比存在顯著性差異。(3)細胞壞死在5-Fu單獨作用48h后參與到5-Fu對腫瘤細胞的抑

13、制作用中來，而直到72h白藜蘆醇才會引起腫瘤細胞的壞死，二者聯(lián)用則從24h即有細胞壞死現(xiàn)象的存在，并呈現(xiàn)時間依賴性。
　　 第二部分5-Fu聯(lián)合白藜蘆醇對腫瘤細胞A431、TE-1周期和增殖的影響
　　 目的：研究了5-Fu聯(lián)合白藜蘆醇對A431、TE-1細胞周期和周期增殖相關(guān)蛋白的影響。
　　 方法：采用流式細胞術(shù)對A431和TE-1的細胞周期進行分析。Western blot檢測周期相關(guān)蛋白和增殖相關(guān)蛋白的表

14、達。
　　 結(jié)果：(1)白藜蘆醇單獨作用24～72h均會引起A431和TE-1細胞的S期數(shù)量增多與相應(yīng)的G1期細胞數(shù)量減少，這種結(jié)果導致了A431和TE-1細胞的S期阻滯現(xiàn)象，與對照組相比，50μM白藜蘆醇對A431作用24h導致A431細胞的S-期比例從29.2±1.4％上升到65.3±2.5％(P＜0.01)。70μM白藜蘆醇對TE-1作用24h導致TE-1細胞的S期比例從26.2±3.2％增長到89.3±3.7％（P＜0.

15、01)。5-Fu單獨用藥組和聯(lián)合給藥組都會引起A431和TE-1的G1期細胞的少量增加，但是這種增加在24h時與對照組相比沒有統(tǒng)計學意義，48h后才與對照組相比出現(xiàn)顯著性差異，而且5-Fu組和聯(lián)合用藥組之間在不同時間點都沒有顯著性差異。(2)Western blot對周期蛋白的分析證實了流式的結(jié)果，白藜蘆醇導致的S期阻滯使CyclinD1和PCNA蛋白的表達量出現(xiàn)減少。
　　 結(jié)論：(1)5-Fu單獨給藥或與白藜蘆醇聯(lián)合使用會使

16、A431和TE-1的細胞周期產(chǎn)生G0/G1期阻滯，白藜蘆醇單獨用藥會對A431和TE-1的細胞周期產(chǎn)生S期阻滯，鑒于5-Fu的抗腫瘤作用機制是與S期特異性殺傷有關(guān)，我們推測可能是白藜蘆醇對細胞周期的影響（將腫瘤細胞大量阻滯于S期）使得A431和TE-1細胞對5-Fu的敏感性增加，從而出現(xiàn)了協(xié)同作用。(2)對腫瘤細胞增殖的抑制可能是其抗癌作用的機制之一，CyclinD1和PCNA蛋白表達的下降也證實了這個假設(shè)。
　　 第三部分5-

17、氟尿嘧啶聯(lián)合白藜蘆醇對A431、TE-1細胞凋亡的影響
　　 目的：研究5-Fu聯(lián)合白藜蘆醇對A431和TE-1細胞凋亡的影響及相關(guān)機制。
　　 方法：采用了普通光鏡，DAPI染色和DNA片段化凝膠電泳分析等方法對藥物誘導A431和TE-1凋亡的現(xiàn)象進行了觀察。使用AnnexinV-PI流式分析術(shù)對細胞的早期凋亡進行分析。測定細胞內(nèi)Ca2+變化，western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白，對5-Fu與白藜蘆醇聯(lián)合給藥的凋亡

18、機制進行研究。
　　 結(jié)果：(1)采用普通光鏡和DAPI染色法觀察了給藥后的A431和TE-1，觀察到A431和TE-1細胞都出現(xiàn)了膜不對稱性和細胞間連接的消失，以及細胞皺縮等現(xiàn)象。DAPI染色可以看到諸如核固縮，染色質(zhì)凝集等現(xiàn)象，并可觀測到凋亡小體。與單獨給藥組相比，聯(lián)合藥物組可以觀察到A431和TE-1細胞更多的形態(tài)學變化。5-Fu和白藜蘆醇作用48h后，光鏡下可以觀察到更多凋亡小體和典型的形態(tài)學變化。(2)給藥后產(chǎn)生凋亡的

19、情況也可以通過檢測DNA梯狀條帶的變化來進行比較，DNA梯狀條帶的數(shù)量可以反映不同藥物的作用情況。5-Fu作用48h后，DNA斷裂不明顯，只有似有似無的現(xiàn)象出現(xiàn)，但是Res作用48h后，可以清晰地辨別出DNA的梯狀條帶(DNA Ladder)，在聯(lián)合藥物組作用48h后，DNA有序片段化更加明顯，條帶增多。(3)采用Annexin V-FITC和PI(propidium iodide)雙染的方法，用流式細胞儀檢測給藥后A431和TE-1細

20、胞的早期凋亡現(xiàn)象。與對照組相比，5-Fu和白藜蘆醇單獨給藥組都出現(xiàn)了早期凋亡細胞比例的明顯增加（P＜0.05）。對照組A431細胞出現(xiàn)了少于6％的自發(fā)早期凋亡；而5-Fu(70μmol/L)或白藜蘆醇(50μmol/L)各自處理24h后分別誘發(fā)了A431細胞19％和9.3％的早期凋亡。二者同時給藥時，出現(xiàn)了凋亡率的大幅增加，約達到34.2％的早期凋亡率(與單藥組相比P＜0.01)。TE-1對照組細胞出現(xiàn)了低于5％的自發(fā)凋亡，5-Fu(1

21、50μmol/L)或白藜蘆醇(70μmol/L)單獨作用24h可分別將TE-1的早期凋亡率提升到11％和7.5％．二者聯(lián)合給藥后TE-1的早期凋亡率增加到24.2％，與單獨給藥組相比有極顯著性差異（P＜0.01)。(4)鈣離子在細胞內(nèi)處于信號轉(zhuǎn)導通路的上游，其變化與凋亡的發(fā)生有關(guān)，5-Fu或白藜蘆醇單獨用均可使細胞中鈣離子的量增加，與單獨給藥相比，兩藥聯(lián)用使細胞中的鈣離子強度與有大量增加，與單獨給藥組呈極顯著性差異(P＜0.01)。為了

22、研究藥物聯(lián)合使用的機制是否與凋亡相關(guān)蛋白的改變有關(guān)，我們用western blot檢測了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3和PARP等的表達。結(jié)果顯示無論是5-Fu或白藜蘆醇都可以誘發(fā)凋亡抑制蛋白Bcl-2表達水平的明顯下降，聯(lián)合藥物組的Bcl-2減少更為明顯。而凋亡促進蛋白Bax和p53的表達水平卻隨著給藥出現(xiàn)大量增加。另外，聯(lián)合用藥組的凋亡促進蛋白與凋亡抑制蛋白的比值(Bax/Bcl-2)與單獨給藥組相比大大增加。藥

23、物作用48h后細胞中caspase-3和PARP蛋白酶原的表達量減少，相應(yīng)活化的caspase-3和PARP片段的表達上調(diào)，與單獨給藥組相比，聯(lián)合用藥組表現(xiàn)出了更為明顯的下降和上調(diào)(P＜0.01)。以上結(jié)果提示5-Fu和白藜蘆醇聯(lián)合用藥產(chǎn)生協(xié)同作用可能與上調(diào)凋亡促進蛋白Bax和p53的表達，下調(diào)凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達有關(guān)。
　　 結(jié)論：(1)5-Fu和Res都可以誘導腫瘤細胞A431、TE-1發(fā)生不同程度的凋亡。(2)5-

24、Fu和Res聯(lián)合使用對腫瘤細胞A431、TE-1的凋亡有協(xié)同作用。(3)5-Fu和Res聯(lián)合使用對腫瘤細胞A431、TE-1凋亡作用機制可能是通過上調(diào)促凋亡基因p53，Bax，下調(diào)Bcl-2基因表達激活線粒體通路，從而活化caspase-3發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)進而活化底物PARP而誘導了細胞凋亡的發(fā)生。
　　 第四部分5-氟尿嘧啶聯(lián)合白藜蘆醇對小鼠兩階段皮膚癌模型的抗腫瘤作用
　　 目的：研究了5-Fu聯(lián)合白藜蘆醇對小鼠兩階段皮

25、膚癌模型的抗腫瘤作用
　　 方法：小鼠皮膚乳頭狀瘤模型采用經(jīng)典的DMBA/TPA兩階段促癌法進行誘發(fā)。western-blot檢測小鼠皮膚腫瘤中p53、Bax和Bcl-2的表達水平。免疫組織化學檢測鼠皮中活化caspase-3的表達。
　　 結(jié)果：(1)給藥后皮膚中p53、Bax的表達水平上升，Bcl-2的表達水平下降，聯(lián)合給藥組組織中促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白的比值(Bax/Bcl-2)明顯增加。(2)5-Fu或白藜蘆醇單

26、獨給藥后均可引起小鼠表皮細胞中caspase-3的活化，聯(lián)合給藥組的活化程度與單獨給藥組相比有明顯的增加。
　　 結(jié)論：(1)與單藥相比，5-Fu和Res聯(lián)合給藥可以對小鼠表皮癌產(chǎn)生良好的治療效果，并減輕5-Fu對皮膚的強烈刺激。(2)5-Fu和Res聯(lián)合給藥可以通過調(diào)節(jié)p53、Bax和Bcl-2基因的表達以及上調(diào)Bax/Bcl-2的比例誘導小鼠表皮腫瘤產(chǎn)生凋亡。(3)5-Fu和Res聯(lián)合給藥還可以使小鼠表皮細胞中的凋亡執(zhí)行因子

27、caspase-3大量活化，從而誘導細胞產(chǎn)生凋亡。
　　 結(jié)論
　　 通過我們的實驗研究可以得出以下結(jié)論：1、5-Fu和Res聯(lián)合給藥對人表皮癌A431和人食管鱗癌TE-1的生長抑制有協(xié)同作用，而且呈現(xiàn)時間和濃度依賴性，與5-Fu和Res單獨用藥相比，可以更好的抑制A431和TE-1細胞的生長曲線和克隆形成，并在一定程度上通過增加A431和TE-1的壞死程度起到腫瘤抑制作用。2、Res可以影響A431和TE-1細胞的細胞

28、周期，將大量細胞阻滯在對5-Fu敏感的S期，同時降低PCNA的表達使細胞增殖減少，而5-Fu和Res聯(lián)合給藥也可將部分細胞阻滯在DNA合成前期從而減少腫瘤細胞的增殖。二者抗腫瘤的協(xié)同作用可能是上述原因綜合作用的結(jié)果。3、5-Fu和Res聯(lián)合給藥與單獨給藥相比能更大程度的影響與凋亡有關(guān)的生物轉(zhuǎn)導因子Ca2+的胞內(nèi)表達和凋亡相關(guān)蛋白的表達（上調(diào)p53、Bax/Bcl-2比例，活化caspase-3，切割其特定底物PARP），產(chǎn)生更強程度的凋