人成熟期增生性瘢痕皮膚與正常皮膚來源的表皮干細胞生物學特性的研究.pdf

1、研究背景
　　皮膚(Skin)是人體最大的器官，作為人體第一道天然屏障，由表皮、真皮、皮下組織及其附屬器組成。表皮干細胞(EpidermalStemCells，ESCs)作為皮膚及其附屬器發(fā)生的源泉，具有維持皮膚新陳代謝和正常生理功能的作用[1-2]。
　　瘢痕(Scar)是皮膚創(chuàng)傷愈合過程中必然的和必需的產(chǎn)物。當皮膚出現(xiàn)創(chuàng)傷時，ESCs具有促進創(chuàng)面再上皮化的能力，主動參與創(chuàng)面修復(fù)從而加速創(chuàng)面愈合。其促進創(chuàng)面愈合的機制可能為

2、:①當皮膚組織受到損傷時，伴隨著修復(fù)信號的啟動，ESCs增殖能力增強，并加速分化為相應(yīng)的細胞并向表皮上層遷移，主動地參與損傷修復(fù)，促進創(chuàng)面愈合;②當損傷創(chuàng)緣毛囊內(nèi)的毛囊干細胞接到損傷修復(fù)的指令，能夠立即啟動毛囊隆突部的毛囊干細胞，主動的參與修復(fù)[3]。近些年來，隨著對表皮干細胞特有的生物學特性研究的深入，人們開始考慮從細胞生物學角度考慮運用表皮干細胞為臨床治療提供新的策略。但其研究的表皮干細胞(ESCs)主要來源于正常皮膚(Normal

3、Skin，NS)，而有關(guān)成熟期增生性瘢痕(HypertrophicScar,HS)表皮干細胞的生物學特性的研究尚無報道。且在整形手術(shù)中，經(jīng)常有大量的瘢痕皮膚被切除丟棄，這就造成了本可再利用的寶貴資源的浪費。因此，本實驗就成熟期增生性瘢痕（瘢痕組）表皮干細胞(HS-ESCs)的生物學特性進行研究，并與正常皮膚（對照組）表皮干細胞(NS-ESCs)進行對比研究，為HS-ESCs的應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。
　　目的
　　1.對HS-ES

4、Cs與NS-ESCs的生物特性進行對比研究，明確HS-ESCs的生物學特性。
　　2.通過明確HS-ESCs的生物學特性，為增生性瘢痕的治療找到一個全新的預(yù)防和治療的方向;
　　3.為HS-ESCs的科學研究和臨床應(yīng)用研究提供前期的研究基礎(chǔ)。
　　材料與方法
　　1.取人成熟期HS和NS，通過HE染色，對比成熟期增生性瘢痕和正常皮膚的組織結(jié)構(gòu)。
　　2.取人成熟期HS和NS，通過免疫組織化學檢測角蛋白19、

5、整合素β1在成熟期HS和NS中的表達情況，確定成熟期HS中是否存在ESCs。
　　3.取人成熟期HS和NS，采用兩步酶消化法分離表皮細胞，Ⅳ膠原快速粘附分選純化ESCs，貼壁培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　4.取原代培養(yǎng)的ESCs，應(yīng)用CCK-8檢測HS-ESCs和NS-ESCs的生長特點，確定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生長特點。
　　5.取原代培養(yǎng)的ESCs，利用免疫細胞化學技術(shù)，檢測角蛋白19、整合素β1

6、及核蛋白p63在HS-ESCs和NS-ESCs的表達情況，確定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生物學特性。
　　6.取原代培養(yǎng)的ESCs，利用流式細胞技術(shù)，檢測角蛋白19、整合素β1及CD49f在HS-ESCs和NS-ESCs的表達情況，并確定原代培養(yǎng)的成熟性HS-ESCs的細胞比例。
　　7.取原代培養(yǎng)的ESCs，利用Western-Blot技術(shù)，檢測角蛋白19、整合素β1及p63蛋白在HS-ESCs和NS-ESCs

7、的表達情況，確定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生物學特性。
　　8.取原代培養(yǎng)的ESCs，利用real-timePCR技術(shù)檢測Oct4基因和Nanog基因在HS-ESCs和NS-ESCs的表達情況，確定HS-ESCs是否具有NS-ESCs的生物學特性。
　　結(jié)果
　　1.通過HE染色，成熟期HS與NS的表皮層細胞排列整齊，層次分明。通過免疫組織化學檢測CK19、整合素β1在成熟期HS和NS中均呈陽性表達，且兩者

8、間表達情況沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，可以推斷成熟期HS存在ESCs。
　　2.原代培養(yǎng)細胞觀察其形態(tài)，HS-ESCs和NS-ESCs均呈水滴狀，橢圓形，呈鋪路石樣排列。CCK-8檢測原代培養(yǎng)的ESCs的增殖能力，第1-2天細胞增殖較慢，3-5天呈對數(shù)增殖，6-7天趨于平緩，兩組間增殖能力沒有統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。
　　3.免疫細胞化學技術(shù)檢測角蛋白19、整合素β1及p63的表達情況，兩組間沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.

9、05);利用流式細胞技術(shù)檢測角蛋白19、整合素β1及CD49f的表達情況，兩組間陽性細胞百分比見存在統(tǒng)計學差異(P＜0.05);WesternBlot檢測CK19、整合素β1及p63蛋白的表達情況，兩組間沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05);real-timeRT-PCR技術(shù)檢測Nanog基因和Oct4基因的表達情況，兩組間沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論
　　1.在成熟期的增生性瘢痕中存在著ESCs;
　　2.通

10、過兩步酶消化法，Ⅳ膠原快速分選能夠從成熟期的增生性瘢痕得到ESCs，且其具有與正常皮膚的ESCs相同的生物學特性，但是成熟期的增生性瘢痕中ESCs數(shù)量較正常皮膚的ESCs少。
　　3.成熟期增生性瘢痕來源的ESCs具有正常皮膚來源的ESCs相同的生物學特性，完全可以替代正常皮膚來源的ESCs應(yīng)用于科學研究中，如組織工程研究人工皮膚等提供皮膚細胞種子等;應(yīng)用于臨床應(yīng)用研究中，如作為皮膚細胞的種子和皮膚更新的源泉，應(yīng)用于臨床修復(fù)難愈性