Cyr61在增生性瘢痕及正常皮膚中的差異表達(dá)及意義.pdf

1、目的：
　　 于組織水平和細(xì)胞水平觀(guān)察Cyr61(cysteine-rich61)在增生性瘢痕及正常皮膚中的表達(dá)差異，并探討Cyr61在增生性瘢痕形成過(guò)程中的意義，為進(jìn)一步研究其作用的信號(hào)通路提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為防治增生性瘢痕提供新的理論依據(jù)和藥物作用靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 1．增生性瘢痕及正常皮膚標(biāo)本的選取臨床上收集手術(shù)切除的人增生性瘢痕和正常皮膚組織，其中增生性瘢痕8例，增生性瘢痕患者在取材前未經(jīng)任何藥物治療

2、，自身不伴有腫瘤或其他嚴(yán)重疾患；正常皮膚8例，其中5例增生性瘢痕和正常皮膚來(lái)自同一病人。
　　 2．免疫組化檢測(cè)Cyr61蛋白表達(dá)通過(guò)免疫組化檢測(cè)Cyr61蛋白在增生性瘢痕及正常皮膚中的表達(dá)及分布情況，采用二步法對(duì)兩組組織切片進(jìn)行染色，于40×10倍光鏡下觀(guān)察，每張片子選擇染色均勻的區(qū)域，取五個(gè)視野拍攝保存，拍攝前設(shè)置白平衡、快門(mén)時(shí)間等參數(shù)一致。將所拍照片導(dǎo)入Image-ProPlus6.0軟件，通過(guò)對(duì)圖片陽(yáng)性表達(dá)的累積光密度值

3、(IntegrateOpticaldensity，IOD)進(jìn)行測(cè)量，將其作為評(píng)價(jià)Cyr61蛋白表達(dá)的指標(biāo)。
　　 3．原代細(xì)胞培養(yǎng)及增殖曲線(xiàn)檢測(cè)取3例來(lái)自同一病人的增生性瘢痕(hypertrophicscar,HS)及對(duì)應(yīng)的正常皮膚(normalskin，NS)作原代細(xì)胞培養(yǎng)，將3例增生性瘢痕培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞歸為HS組，3例正常皮膚培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)胞歸為NS組。并取其中1例增生性瘢痕及對(duì)應(yīng)的正常皮膚成纖維細(xì)胞，采用甲基噻唑基四唑(Me

4、thylthiazolyltetrazolium,MTT)法分別于培養(yǎng)后12h、24h、36h、48h、72h、96h測(cè)定其光吸收值，作兩種細(xì)胞的自然增殖曲線(xiàn)。
　　 4．定量實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)Cyr61基因的表達(dá)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞及正常皮膚成纖維細(xì)胞，以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參照，做定量實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈

5、反應(yīng)(Quantitativereal-timereversetranscriptionpolymerasechainreaction，qRT-PCR)檢測(cè)，每例細(xì)胞做3次重復(fù)，采用相對(duì)定量法，以2-△Ct表示目的基因相對(duì)于內(nèi)參的相對(duì)表達(dá)量，其中△Ct=CtCyr61-CtGAPDH，于基因水平檢測(cè)Cyr61mRNA在兩組細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 5．細(xì)胞免疫化學(xué)法檢測(cè)Cyr61蛋白的表達(dá)取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的增生性瘢痕成纖維細(xì)胞及正常

6、皮膚成纖維細(xì)胞，行細(xì)胞免疫熒光法，每例細(xì)胞做3次重復(fù)，并利用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察Cyr61在兩種細(xì)胞中的表達(dá)定位，調(diào)整發(fā)射光波長(zhǎng)495nm，激發(fā)光波長(zhǎng)488nm，于10×10倍光鏡下選擇染色均勻的區(qū)域，取五個(gè)視野拍攝保存，將所拍照片導(dǎo)入Image-ProPlus6.0軟件，通過(guò)對(duì)圖片陽(yáng)性表達(dá)的累積光密度進(jìn)行測(cè)量，將其作為評(píng)價(jià)Cyr61蛋白在兩組細(xì)胞中表達(dá)的指標(biāo)。
　　 結(jié)果：
　　 1．免疫組化檢測(cè)Cyr61蛋白表達(dá)增生

7、性瘢痕組織及正常皮膚組織的表皮層和真皮層中，均能發(fā)現(xiàn)Cyr61蛋白表達(dá)，免疫組化結(jié)果通過(guò)Image-ProPlus6.0計(jì)算，得出Cyr61在增生性瘢痕組和正常皮膚組表達(dá)的累積光密度值(IOD)分別為85.85±11.52和44.50±8.16。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，HS組及NS組IOD比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2．原代細(xì)胞培養(yǎng)及增殖曲線(xiàn)檢測(cè)體外培養(yǎng)的增生性瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞鏡下形態(tài)觀(guān)察為梭形，胞漿豐富胞體較大，

8、兩種細(xì)胞形態(tài)上無(wú)明顯差別。MTT法檢測(cè)接種12h，24h，36h，48h，72h，96h后增生性瘢痕成纖維細(xì)胞平均OD值為分別為(0.16±0.01，0.20±0.01,0.24±0.02,0.24±0.04,0.18±0.05,0.16±0.03)，正常皮膚成纖維細(xì)胞平均OD值分別為(0.14±0.01，0.18±0.01，0.24±0.02，0.27±0.02，0.22±0.02，0.16±0.02)繪制細(xì)胞自然增殖曲線(xiàn)表明兩種細(xì)胞

9、均為穩(wěn)定型成纖維細(xì)胞，可以滿(mǎn)足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)需要；
　　 3．RT-PCR檢測(cè)Cyr61基因的表達(dá)對(duì)正常皮膚成纖維細(xì)胞及增生性瘢痕成纖維細(xì)胞進(jìn)行qRT-PCR法檢測(cè)Cyr61mRNA的表達(dá)情況，通過(guò)計(jì)算△Ct值，3例正常皮膚成纖維細(xì)胞平均△Ct分別為2.88±0.26，2.25±0.27，2.46±0.22，3例增生性瘢痕成纖維細(xì)胞平均△Ct分別為3.81±0.17，3.92±0.12，3.36±0.22，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組結(jié)果比較

10、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 4．細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)Cyr61蛋白的表達(dá)
　　 細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)后顯示Cyr61在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞及正常皮膚成纖維細(xì)胞均有表達(dá)，應(yīng)用Image-ProPlus6.0軟件分析免疫熒光圖后，得出Cyr61在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞和正常皮膚成纖維細(xì)胞表達(dá)的累積光密度值(IOD)分別為(0.040±0.002，0.046±0.001，0.055±0.001)和(0.016±0.001，