NRCF動態(tài)蛋白組學測定、生物信息學分析及其功能的初步實驗研究.pdf

1、周圍神經損傷(peripheral nerve injuries，PNI)，是一類高發(fā)生率、高致殘性的常見創(chuàng)傷，其發(fā)生的常見原因為意外傷害、疾病或者需要分離周圍神經到達毗鄰手術部位的外科操作等。對周圍神經損傷處理不當，可引起其部分或全部功能喪失，影響患者生活質量，甚至造成患者殘疾，給社會造成巨大的經濟負擔。
　　臨床工作中，周圍神經損傷最常用的處理方法為斷端直接縫合法和自體神經移植術。但因神經功能束的錯位、吻合口瘢痕等，療效難以進

2、一步提高，并可造成供區(qū)的繼發(fā)性損傷。因此，周圍神經擬生態(tài)結構再生成為了機理研究的重要方向，也是對周圍神經再生研究的新思路。研究表明，周圍神經再生依賴于具備自我調控、自我完善機制的微環(huán)境。目前，基于神經再生室(nerveregeneration chambers，NRC)修復為核心的，綜合應用功能細胞植入及基因治療等多種措施的生物學治療方法，取得了突破性進展，是周圍神經再生研究的方向。
　　20世紀80年代，LundborgG和他的

3、合作者采用了圓筒狀NRC模型成功修復了大鼠周圍神經的離斷缺損，從而成為研究周圍神經損傷的標準動物模型。此后，研究者對LundborgG NRC模型的管腔材料、管腔內容物、可溶性調節(jié)成分和功能細胞等進行了相關研究。NRC模型所提供的封閉微環(huán)境是研究周圍神經再生的重要窗口。而神經再生條件液(nerve regeneration conditioned fluid，NRCF)是NRC模型中自神經斷端分泌的功能性液體，其來源于周圍神經的組成細胞

4、，或經軸突順向轉運、逆向彌散而來的物質成分，主要組成為蛋白，其在周圍神經再生不同時期的表達存在種類和數量的動態(tài)變化。研究表明，NRCF對再生神經提供支持、營養(yǎng)和導向等重要作用。
　　周圍神經損傷的修復是一個復雜的、精細的生理過程。周圍神經功能性再生取決于特定微環(huán)境和神經元自身生長能力的共同作用。相對于激活神經元自身生長能力是其固有特性方面，對損傷所處的特定微環(huán)境研究就更為重要。神經再生室模型(NRC)所提供的封閉微環(huán)境作為研究周圍

5、神經再生的重要窗口，而神經再生條件液(NRCF)是NRC中的功能性成分，對其進行研究將是揭示周圍神經再生機理的重要途徑。但目前，對周圍神經再生的微環(huán)境因素，如細胞外基質、神經營養(yǎng)因子和細胞因子等，進行了大量研究，但都是隨機的、散在的和推測的。因此，對NRCF中蛋白成分譜的描繪，可為研究微環(huán)境在周圍神經再生中的作用提供直接依據，對闡明再生機制具有重要指導意義。而蛋白組學技術的發(fā)展為此提供了研究的方法基礎。相對和絕對定量的等量異位標簽(is

6、obaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技術是目前先進的蛋白組學技術，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質的相對含量或絕對含量，w為目前研究NRCF中整體蛋白成分和時間差異表達的有效方式。
　　鑒于微環(huán)境在周圍神經損傷修復中的重要作用，對其功能性成分(NRCF)進行研究將是了解周圍神經再生機理的重要途徑。本課題首次采用iTRAQ技術對周圍神經再生四個關鍵時

7、間點(神經離斷3d，7d，14d和25d) NRCF的蛋白成分做了整體的、全景的動態(tài)呈現和分析，通過比對蛋白質組數據庫，對共表達蛋白進行了生物信息學分析，發(fā)現了某些關鍵蛋白和周圍神經再生的關系。通過實驗初步探討了NRCF對雪旺細胞和成纖維細胞增殖的影響。并結合前期研究成果，討論了NRCF中不同補體成分參與周圍神經再生過程的動態(tài)變化及其意義。
　　第一部分:NRC模型的建立、NRCF的提取及對雪旺細胞和成纖維細胞增殖的影響
　

8、　目的：
　　典型的神經再生室(NRC）模型為連接神經兩斷端的圓筒狀硅膠或其他材質所形成的密閉的間隙，其所提供的封閉微環(huán)境是研究周圍神經再生的重要窗口，而神經再生條件液(NRCF)是NRC模型中自神經斷端分泌的功能性成分，可對再生神經提供支持、營養(yǎng)和導向作用。雪旺細胞(schwann cell，Sc)及成纖維細胞（fibroblast cell，Fb）是參與周圍神經再生的主要功能細胞。本部分實驗采用Lewis大鼠坐骨神經(scia

9、tic nerve)建立NRC模型，提取NRCF，并采用CCK-8法及流式細胞儀檢測，探討NRCF對雪旺細胞和成纖維細胞增殖的影響。
　　方法：
　　Lewis大鼠坐骨神經10mm離斷缺損，采用特定規(guī)格硅膠管體內建立NRC模型、7d時提取NRCF。BCA法進行NRCF蛋白濃度測定。雪旺細胞和成纖維細胞細胞株的傳代培養(yǎng)。CCK-8法和流式細胞術檢測NRCF對雪旺細胞和成纖維細胞增殖的影響。
　　結果：
　　NRCF

10、為清澈、淡黃色、呈類血清樣并稍粘稠的液體，濃度為15.01μg/μl。雪旺細胞呈類圓形或梭形胞體，部分有兩個或兩個以上的突起，而成纖維細胞細胞體較大，呈棱形、長條狀或不規(guī)則三角形，融合后為編織狀，細胞核一般呈長橢圓形。NRCF能顯著促進雪旺細胞(Sc)、成纖維細胞(Fb)的增殖，并且此作用呈時間、濃度依賴性，促進該兩種細胞增殖的有效濃度為10000ng/ml。
　　結論：
　　1.采用Lewis大鼠坐骨神經建立NRC模型，模

11、型穩(wěn)定、可靠，提取NRCF質量能很好滿足實驗要求。Lewis Rat Sciatic Nerve-NRC模型是研究周圍神經再生的有效途徑。
　　2.采用CCK-8法及流式細胞儀檢測技術，初步證明神經再生條件液(NRCF)具有促進雪旺細胞及成纖維細胞增殖的生物活性。
　　第二部分 NRCF-i TRAQ蛋白組學研究和生物信息學分析
　　目的：
　　神經再生條件液(NRCF)是NRC中神經斷端分泌的功能性成分，主要為

12、蛋白成分，對NRCF中的蛋白成分進行研究將為揭示周圍神經再生機理提供一個平臺。本部分實驗采用iTRAQ蛋白組學技術聯合質譜技術，以周圍神經再生四個關鍵時間點（坐骨神經離斷3d，7d，14d和25d）所提取的NRCF為研究對象，對NRCF每個時間點、全部時間點及其各個時間點之間的蛋白定性和定量表達情況進行分析，并通過比對蛋白質組數據庫，對共表達蛋白進行了進一步的生物學信息分析。
　　方法：
　　建立NRC模型、提取3d，7d，

13、14d和25d NRCF材料及其NRCF樣品處理。SDS-PAGE電泳。iTRAQ蛋白組學技術、質譜鑒定。GO分析、KEGG通路分析、分層聚類分析、共趨勢分析、時序表達的基因篩選等生物信息學分析方法對NRCF蛋白進行定性、定量分析。
　　結果：
　　3d，7d，14d和25d NRCF4組樣品蛋白質條帶分布較均一，平行度良好。3d，7d，14d和25d神經再生條件液(NRCF)中共鑒定出876個蛋白，其中，3d，7d，14d

14、和25d神經再生條件液(NRCF)中蛋白個數分別為:536、645、376和548個，其獨特蛋白質個數分別為:95、137、18和58個，共同蛋白質個數為264個。
　　共表達蛋白定量生物信息學分析顯示:KEGG Pathway所得到的TOP10通路為:補體及凝血級聯、金黃色葡萄球菌感染、系統性紅斑狼瘡、百日咳、粘著斑、朊病毒、阿米巴病、肌動蛋白骨架調節(jié)、糖酵解/糖異生、ECM受體作用等。共趨勢分析第2組、第3組和第4組TOP7蛋

15、白分別為PROFILIN-1、DESTRIN-LIKE、 ACTIN-RELATED PROTEIN2/3 COMPLEX SUBUNIT2、ANNEXIN A1、CORONIN-1A、PROTEIN S100-A8和PROTEIN S100-A9等;CLUSTERIN、 EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR、RETINOL-BINDING PROTEIN4、COLLAGEN ALPHA-2(I) CHAIN

16、、 HIGH MOBILITYGROUP PROTEIN B2-LIKE、 LIVER CARBOXYLESTERASE1和COMPLEMENT FACTOR I等;EUKARYOTIC TRANSLATION ELONGATIONFACTOR1 ALPHA2、HEMOGLOBIN SUBUNIT ALPHA-1/2、 HEMOGLOBINALPHA2 CHAIN、 SUPEROXIDE DISMUTASE[CU-ZN].、 GALEC

17、TIN-5、ISOFORM2 OF GROWTH FACTOR RECEPTOR-BOUND PROTEIN2和CARBONIC ANHYDRASE2等。顯著差異蛋白和高連接度信息蛋白為GRB2、ACTB、ALB、VIM、VCP、A2M、CALR、THBS1、TF和PEBP1等。
　　結論：
　　1.采用iTRAQ蛋白組學技術聯合質譜技術，對周圍神經再生的四個關鍵時間點的NRCF蛋白進行了全景的、動態(tài)的分析，建立了一個相對完

18、整的NRCF蛋白數據庫。NRCF蛋白含量豐富，種類繁多，每個關鍵時間點既有特異蛋白，各個關鍵時間點也有共同蛋白，與周圍神經再生不同階段關系密切。
　　2.數據分析篩選出周圍神經再生的不同關鍵時間點的特異蛋白、共趨勢分析篩選出的不同組別的高表達蛋白和時序表達的基因篩選所獲得的顯著表達蛋白等，為尋找影響周圍神經再生的關鍵蛋白提供了依據。這些數據，不僅，豐富了對周圍神經再生的認識，而且，為將來神經再生課題提供了眾多的基因和蛋白研究靶點。

19、
　　3.NRCF蛋白的全景揭示和相關文獻復習，對既往神經再生所取得的研究成果也進行了部分驗證，并為深入研究再生理論開辟了新的途徑。
　　第三部分 NRCF中補體成分及與周圍神經再生關系
　　目的：
　　NRCF蛋白譜提示，補體系統成分的大量存在，并在不同神經再生時期具有明顯的動態(tài)變化。生物學分析（KEGG通路分析）表明補體通路位居前十個顯著富集通路。補體系統在周圍神經再生過程中所起的作用非常值得研究。補體系統（

20、幾種或一種關鍵成分）所介導的免疫反應、炎癥反應，甚至與兩者無關，但與神經再生相關的作用于PNI中亟待揭示。本部分將對NRCF-iTRAQ蛋白組學結果發(fā)現的大量補體成分及其動態(tài)變化加以描述、分析和總結，并采用Westernblot技術對NRCF中部分補體成分加以驗證，對其可能參與周圍神經再生的作用機制加以探討。
　　方法：
　　建立NRC模型、提取7dNRCF及其NRCF樣品處理。iTRAQ蛋白組學技術相關方法（同第二部分）。

21、Western blot實驗技術檢測C1q、C3、C7和CFD在NRCF中的表達。
　　結果
　　NRCF-iTRAQ蛋白組學分析所得10種補體成分分別為CFI、C1q-A、C1q-B、C2、C3、C4、C5、C7、C8β和CFD等。Western blot證實NRCF中有C1q、 C3、C7和CFD的表達。
　　結論：
　　NRCF中有10余種補體成分定性和定量信息的存在，補體C7在再生不同時間階段量化分析有顯