低血糖性腦損傷蛋白組學(xué)分析及DJ-1蛋白功能研究.pdf

1、背景:
　　低血糖是糖尿病患者強(qiáng)化血糖控制的常見(jiàn)并發(fā)癥。低血糖最容易導(dǎo)致腦損傷?！捌咸烟窃俟嘧⑿阅X損傷”概念的提出，使得人們對(duì)低血糖性腦損傷發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)更加復(fù)雜，也引發(fā)了對(duì)傳統(tǒng)臨床低血糖救治的再思考。研究低血糖發(fā)作及恢復(fù)過(guò)程中與腦損傷有關(guān)的病理機(jī)制，有可能為臨床低血糖救治過(guò)程中提供腦保護(hù)治療的靶標(biāo)和思路。
　　目的:
　　本研究旨在采用同位素相對(duì)標(biāo)記與絕對(duì)定量技術(shù)(Isobaric tag forrelative a

2、nd absolute quantitation， ITRAQ)連同多維液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)尋找低血糖大鼠與正常大鼠腦組織內(nèi)的差異表達(dá)蛋白，對(duì)其進(jìn)行表達(dá)量的驗(yàn)證及相關(guān)生物學(xué)功能探討，初步闡明低血糖性腦損傷發(fā)病的相關(guān)分子機(jī)制，為低血糖性腦損傷的治療提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　注射胰島素建立低血糖大鼠腦損傷模型，提取腦組織蛋白，酶解后用iTRAQ化學(xué)標(biāo)簽標(biāo)記，進(jìn)行多維液相色譜分離—串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，篩選

3、潛在的可能與低血糖性腦損傷相關(guān)的差異蛋白。選取差異表達(dá)明顯且生物學(xué)功能相關(guān)者在重新建立的動(dòng)物模型上進(jìn)行mRNA和蛋白水平的表達(dá)量驗(yàn)證。最后在模擬低血糖的體外無(wú)糖培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞模型上利用RNA干擾技術(shù)進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)功能的初步研究。
　　結(jié)果:
　　通過(guò)比較低血糖大鼠與假造模大鼠腦組織的蛋白表達(dá)，以相對(duì)表達(dá)量≥1.5或≤0.67為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選到147種差異表達(dá)蛋白。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)和免疫印跡法在復(fù)制的動(dòng)物模型上證實(shí)

4、AQP4，NDRG1，DJ-1和Clusterin四個(gè)蛋白的表達(dá)量與在蛋白組學(xué)中發(fā)現(xiàn)的表達(dá)量變化趨勢(shì)一致。在模擬的體外星形膠質(zhì)細(xì)胞缺糖模型上進(jìn)一步驗(yàn)證了缺糖上調(diào)AQP4和DJ-1兩個(gè)蛋白的表達(dá)量。沉默DJ-1蛋白后，星形膠質(zhì)細(xì)胞在無(wú)糖培養(yǎng)時(shí)死亡率明顯增加。將星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行無(wú)糖培養(yǎng)，觀察到AMPK通路被激活，自噬被啟動(dòng)，但自噬通量受損。工具藥抑制自噬后無(wú)糖培養(yǎng)致星形膠質(zhì)細(xì)胞死亡明顯增加。與正常表達(dá)D J-1的細(xì)胞比較，沉默DJ-1表達(dá)的