非Smad通路在小鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、第一部分CT26-Smad4KD細胞系的建立及鑒定
　　目的:建立CT26-Smad4KD穩(wěn)定細胞系并對其進行鑒定。方法:選用小鼠結(jié)腸癌細胞系CT26作為研究對象。以已被文獻驗證的有效shRNA序列為干擾序列并使用通用陰性對照序列,分別構(gòu)建vshRNA載體。轉(zhuǎn)染293T細胞包被慢病毒顆粒。在野生型CT26細胞系中,采用慢病毒感染的方式建立Smad4干擾組以及相應(yīng)的空載體對照組。使用puromycin篩選獲得陽性細胞克隆。以west

2、ernblot和Co-immunoprecipitation檢測上述細胞克隆中Smad4蛋白的表達情況及Smad2/3/4復(fù)合物的形成情況。并對非Smad通路中MAPK通路進行初步檢測。結(jié)果:在含polybrene5μg/ml的RPMI-1640培養(yǎng)基做溶媒,MOI=50時,慢病毒在CT26細胞感染效率最高。經(jīng)westernblot檢測,野生型CT26細胞和陰性對照克隆均正常表達Smad4,干擾組中,Smad4KD＃1、Smad4KD＃

3、8和Smad4KD＃18克隆的Smad4表達下降明顯,干擾效果好。經(jīng)Co-immunoprecipitation檢測,無論是否給予外源性TGF-β,CT26-Smad4KD細胞系均不能形成正常水平的Smad2/3/4復(fù)合物。結(jié)論:成功建立CT26-Smad4KD細胞系及其陰性對照。
　　第二部分:干擾Smad4抑制CT26細胞的增殖，促進其凋亡
　　目的:探討Smad4蛋白在小鼠結(jié)腸癌細胞增殖中的作用。方法:選用小鼠結(jié)腸癌細

4、胞系CT26、其陰性對照NC及敲減Smad4的細胞系CT26-Smad4KD作為研究對象。通過CCK-8實驗,觀察及比較野生型CT26細胞、陰性對照組及Smad4KD細胞的生存曲線,以及在給予外源性TGF-β條件下,其細胞增殖能力。然后,通過軟瓊脂糖克隆形成實驗,檢測野生型CT26細胞在敲減Smad4蛋白后,其在半固態(tài)懸浮環(huán)境中的非錨定增殖能力。接下來,我們使用AnnexinV-FITC/PI雙染細胞凋亡實驗在流式細胞儀上比較野生型CT

5、26細胞干擾Smad4蛋白前后,在細胞凋亡的改變。最后,我們在Balb/c-nu鼠進行了體內(nèi)實驗。我們將野生型CT26與Smad4KD細胞分別注射到Balb/c-nu鼠皮下,觀察其體內(nèi)成瘤能力。結(jié)果:CCK-8實驗結(jié)果表明,在未給予外源性TGF-β條件下,干擾Smad4后,CT26細胞的增殖能力在第48h開始,較野生組和陰性對照組有明顯降低;而陰性對照組與野生型則嗚顯著差異。干擾Smad4后,CT26細胞的增殖能力下降了約25％,而陰性

6、對照NC組無明顯變化。而給予外源性TGF-β刺激時,野生型CT26、陰性對照NC組及Smad4KD三組細胞之間增殖無顯著性差異。Smad4蛋白在小鼠結(jié)腸癌細胞CT26的增殖中起促進作用,并且干擾Smad4蛋白之后,細胞對外源性TGF-β的生長抑制效應(yīng)失去應(yīng)答。然后,軟瓊脂克隆形成實驗結(jié)果表明,敲減Smad4的小鼠結(jié)腸癌細胞CT26的克隆形成明顯比野生型及陰性對照組的細胞少,而且所形成的克隆直徑也小于野生型和陰性對照組。AnnexinV-

7、FITC/PI雙染細胞凋亡實驗提示,與野生型CT26及其陰性對照組相比,Smad4KD細胞活細胞百分比明顯降低,早其凋亡及死亡細胞顯著增加。而給予外源性TGF-β之后,野生型CT26細胞、陰性對照及Smad4KD細胞的凋亡細胞百分比未有明顯變化。而皮下成瘤體內(nèi)實驗提示,與野生型CT26細胞所成皮下腫瘤相比,Smad4KD形成的皮下瘤塊明顯較小。野生型CT26所成皮下腫瘤體積為5865.73±1630.00mm3,而Smad4KD所成皮下

8、腫瘤體積為955.37±297.96mm3。干擾Smad4使CT26細胞所形成的皮下腫瘤體積顯著減小。結(jié)論:干擾Smad4抑制CT26細胞增殖及克隆形成,促進其凋亡。
　　第三部分:干擾Smad4促進CT26細胞的遷移能力
　　目的:探討Smad4蛋白在小鼠結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移表型中的作用。方法:我們以小鼠結(jié)腸癌細胞CT26、陰性對照細胞及CT26-Smad4KD細胞作為研究對象,利用劃痕實驗、transwell細胞遷移及細胞侵襲

9、實驗,評估野生型CT26細胞、陰性對照組及Smad4KD細胞的橫向爬行能力、縱向遷移及侵襲能力。然后,我們結(jié)合TGF-β與MAPK/JNK抑制劑SP600125,以及MAPK/ERK抑制劑PD98059和U0126,使用transwell細胞遷移實驗研究Smad4KD細胞在阻斷JNK或ERK通路后,其縱向遷移能力的變化。結(jié)果:劃痕實驗結(jié)果表明,劃痕36小時后,給予外源性TGF-β后,野生型CT26細胞向無細胞區(qū)爬行增多;而Smad4KD

10、細胞在未給予外源性TGF-β條件下,其細胞側(cè)向爬行能力已經(jīng)明顯超過野生型CT26細胞,給予外源性TGF-β刺激后,爬行能力明顯增強。此后,transwell細胞遷移實驗結(jié)果表明,鋪細胞24小時后,野生型CT26細胞每個高倍視野下,穿過8um的transwell膜細胞數(shù)目為23.4±13.13個,兩個陰性對照克隆穿過數(shù)分別為24.43±11.43和23.85±15.89個。而敲減Smad4后,其穿過能力明顯增強,三個Smad4KD細胞克隆