MYCT1在Wnt信號(hào)通路及結(jié)腸癌發(fā)生中的作用研究.pdf

1、Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中和腫瘤發(fā)生中起到極其重要的作用。研究表明:大約90％的腸道癌癥是由于Wnt信號(hào)通路的異常激活引起的,另外有80％的結(jié)腸癌是因?yàn)锳PC基因的突變導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路的異常激活而導(dǎo)致的
　　 MYCT1(myc target1)基因最初發(fā)現(xiàn)于喉癌細(xì)胞中,后因發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子上有兩個(gè)E-box即c-MYC結(jié)合位點(diǎn),故命名為myc target1。孫開(kāi)來(lái)等人研究發(fā)現(xiàn)MYCT1的表達(dá)量在喉癌、肝癌等

2、癌癥組織中低于相應(yīng)癌旁組織。MYCT1過(guò)表達(dá)還能抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng),國(guó)內(nèi)研究人員將MYCT1定義為一種抑癌基因。國(guó)外研究人員對(duì)鼠源的MYCT1蛋白進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),MYCT1蛋白在許多方面能起到替代MYC蛋白的作用。其功能之強(qiáng)大得到了眾多科學(xué)家的肯定。
　　 在本研究課題中,我們利用攜帶有MYCT1 shRNA的非復(fù)制型腺病毒對(duì)MYCT1在Wnt信號(hào)通路及結(jié)腸癌發(fā)生中的作用進(jìn)行研究。研究結(jié)果表明,MYCT1蛋白能夠通過(guò)同β-calen

3、in和TCF-4相結(jié)合的方式調(diào)控Wnt信號(hào)通路,并且在SW480的裸鼠皮下結(jié)腸癌模型中的實(shí)驗(yàn)中,MYCT1在結(jié)腸癌的發(fā)生及生長(zhǎng)中起到了重要的作用。
　　 [實(shí)驗(yàn)方法]
　　 本實(shí)驗(yàn)室利甩Adeasy系統(tǒng)成功構(gòu)建出攜帶有靶向MYCT1 mRNA的非復(fù)制型腺病毒,命名為ad-shMYCT1;另外構(gòu)建一對(duì)應(yīng)非復(fù)制型腺病毒ad-shGPF作為對(duì)照病毒。構(gòu)建好的病毒經(jīng)鑒定正確后,通過(guò)在HEK293細(xì)胞中擴(kuò)增,并運(yùn)用CsCl密度梯度

4、離心純化得到高低度的病毒。純化后的病毒運(yùn)用TCID50法在HEK293中測(cè)出其滴度后方可用于實(shí)驗(yàn);運(yùn)用Western blotting、RT-qPCR和luciferase reporter實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ad-shMYCT1對(duì)Wnt下游基因轉(zhuǎn)錄激活的影響;免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)被運(yùn)用于檢測(cè)MYCT1蛋白相互作用的蛋白;運(yùn)用裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)和免疫組化實(shí)驗(yàn)研究MYCT1在結(jié)腸癌發(fā)生及生長(zhǎng)中的作用。
　　 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
　　 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,

5、ad-shMYCT1能夠下調(diào)Wnt下游基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平,并能夠顯著抑制TCF-4轉(zhuǎn)錄調(diào)控的活性。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)表明MYCT1可能依靠與β-Catenin和TCF-4相結(jié)合的方式參與Wnt信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明,ad-shMYCT1對(duì)SW480荷瘤具有良好的治療效果:實(shí)驗(yàn)組裸鼠接受ad-shMYCT1治療后腫瘤生長(zhǎng)受到明顯抑制,而注射了PBS或者ad-shGPF后對(duì)照組裸鼠腫瘤生長(zhǎng)迅速;實(shí)驗(yàn)組裸鼠的生存時(shí)間也明顯比對(duì)照組

6、裸鼠的要長(zhǎng)。免疫組化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證明ad-shMYCT1能夠下調(diào)結(jié)腸癌標(biāo)志物CD44的表達(dá)。
　　 [結(jié)論]
　　 本文通過(guò)在BJ5183感受態(tài)細(xì)菌中重組、HEK293細(xì)胞中包裝產(chǎn)生腺病毒的方法成功得到了不含野生型腺病毒污染的攜帶有MYCT1 shRNA和GFP shRNA的非復(fù)制型腺病毒。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:運(yùn)用ad-shMYCT1下調(diào)MYCT1表達(dá)能夠顯著抑制Wnt信號(hào)通路的激活,并抑制結(jié)腸癌的生長(zhǎng)。MYCT1能夠作為基因