i-TAC-CXCR3誘導血管生成擬態(tài)形成在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、一.研究背景:
　　 1.探究預(yù)測轉(zhuǎn)移機制是影響結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移預(yù)后的關(guān)鍵因素。
　　 結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見惡性腫瘤，發(fā)病率占胃腸道腫瘤的第3位。近年來由于醫(yī)療水平的進步多數(shù)患者得以在早期發(fā)現(xiàn)并進行相應(yīng)治療，然而即使在早期切除原發(fā)腫瘤后，大約40％的患者在5年內(nèi)出現(xiàn)腹腔復發(fā)和肝轉(zhuǎn)移，而且其發(fā)病率逐年上升[1]。Tsai等[2]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌同時伴有肝轉(zhuǎn)移行同期肝切除手術(shù)5年生存率只有16.8％。化療（肝灌注化療）因為靶向性不

2、高，對正常組織損傷較大，對患者長期生存無顯著改善作用。冷凍消融和射頻消融對殺滅腫瘤細胞有確切效果，但其是否可以延長總體的生存時間，尚未有明確結(jié)論。目前認為，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的過程包括細胞外基質(zhì)(ECM)的降解、細胞黏附性能的改變、腫瘤細胞局部浸潤、腫瘤血管生成、腫瘤細胞循環(huán)內(nèi)播散和免疫逃逸、腫瘤細胞血管內(nèi)栓塞及腫瘤細胞在新的微環(huán)境重新生長等幾方面[3，4]。尋找更為有效的干預(yù)方法及探究預(yù)測轉(zhuǎn)移機制是解決問題的關(guān)鍵所在。
　　 2.目

3、前血管生成在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中的研究現(xiàn)狀
　　 在腫瘤形成及轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤血管生成起了非常重要的作用。腫瘤的一個亞群細胞轉(zhuǎn)換為有血管生成基因的表型(an angiogenic phenotype)后，新生血管就開始迅速生成，腫瘤將進一步生長并發(fā)生轉(zhuǎn)移[5]。Strieter提出在惡性腫瘤的生長和發(fā)展過程中存在血管生成因子及血管穩(wěn)定因子之間的失衡[6]。腫瘤細胞可以通過過度表達一種或多種正性的血管生成調(diào)節(jié)因子、促使細胞間質(zhì)含有的血管

4、生成蛋白的釋放、促宿主相關(guān)細胞釋放其內(nèi)的血管生成因子等方式來促進局部血管生成。促腫瘤血管生成的最重要的因子是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。在結(jié)腸癌，VEGF是影響結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的重要因素[7]。除了VEGF外，血小板源性內(nèi)皮細胞生長因子(PD-ECGF)在結(jié)腸癌的血管生成過程中也有重要作用。PD-ECGF是一種促血管生成因子，在低VEGF表達的富含血管生成的結(jié)腸癌中，PD-ECGF可能有重要作用。
　　 血管生成擬態(tài)是一種與經(jīng)典腫

5、瘤血管生成途徑不同，不依賴于機體內(nèi)皮細胞的全新腫瘤微循環(huán)模式。在血管生成方面，既往對結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的研究集中在腫瘤血管密度的增加和血管因子的生成方面。但血管生成擬態(tài)的形成是否和結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移有關(guān)，目前無系統(tǒng)研究。
　　 3.I-TAC—CXCR3誘導血管生成的研究現(xiàn)狀
　　 趨化因子的主要作用是趨化細胞的遷移，細胞沿著趨化因子濃度增加的信號向趨化因子源處遷徙。最近研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子作為腫瘤微環(huán)境中關(guān)鍵信號分子，在腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)

6、移中起著重要的作用。1998年首次證實βR-1基因編碼的產(chǎn)物為趨化因子I-TAC，編碼基因位于人染色體4q21.2。由94個氨基酸組成（包括21氨基酸信號序列），成熟I-TAC由73個氨基酸組成，分子量約為8300[8]，屬于ELRCXC趨化因子家族。I-TAC受體為CXCR3，由368個氨基酸組成，其編碼基因位于人染色體Xq13。CXCR3分子結(jié)構(gòu)中含有7個富含巰基氨基酸的α螺旋穿膜區(qū)，屬于7次跨膜轉(zhuǎn)運G蛋白偶聯(lián)受體超家族，經(jīng)異源三聚

7、體G蛋白傳遞信號。CXCR3不僅是I-TAC的受體，也是Mig、IP-10的受體。其主要分布在Th1細胞和B細胞，NK細胞和EC也有表達[9]。在血管生成方面，I-TAC可以作為血管生成或抗血管生成的因子，而且I-TAC和CXCR3還可以與VEGF相互協(xié)同作用。癌細胞可以直接產(chǎn)生I-TAC，也可以通過調(diào)控周圍的炎癥細胞來釋放I-TAC進行血管生成的調(diào)控。此外，CXCR3還可以直接調(diào)控細胞的凋亡[10]。趨化因子I-TAC血管調(diào)控作用同C

8、XCR3的結(jié)合是相關(guān)聯(lián)的[11]。
　　 目前研究指出，I-TAC—CXCR3不但介導癌細胞的定向移動，還參與了包括穿入血管，錨定，穿出血管，免疫逃逸，增殖并血管生成等每個過程[12]。在胃癌手術(shù)切除標本中發(fā)現(xiàn)腫瘤組織CXCR3表達明顯高于相應(yīng)癌旁組織，胃癌細胞系CXCR3也升高[13]。推斷CXCR3及其配體以協(xié)同作用的方式與粘附分子合作來決定腫瘤細胞的侵襲及增殖能力。研究報道腎癌[14]和黑色素瘤[15]細胞可表達CXCR3

9、，并通過與其配體作用，介導癌細胞的定向移動和增殖。在小鼠模型中，如提高CXCL9和CXCL10的水平，高轉(zhuǎn)移黑色素瘤細胞系B16F10的轉(zhuǎn)移能力可再提高3倍，而使用反義RNA降低B16F10細胞的CXCR3表達，或者使用抗體中和CXCL9和CXCL10的作用，則該細胞幾乎失去轉(zhuǎn)移能力[16]。血管生成是生成新血管、修復損傷血管的生理和病理過程。這個過程受到促血管生成因子和抑制血管生成因子的調(diào)控。
　　 我們提出以下問題:I-TA

10、C—CXCR3是否誘導結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移，血管生成擬態(tài)在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用如何？I-TAC—CXCR3誘導血管生成擬態(tài)形成是否是結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移機制之一？
　　 綜上所述，本研究擬:(1)應(yīng)用免疫組化方法檢測結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移病人結(jié)腸腫瘤和肝臟轉(zhuǎn)移瘤的I-TAC—CXCR3表達;應(yīng)用PAS染色、CD31雙重染色檢測結(jié)腸癌組織及肝轉(zhuǎn)移瘤中血管生成擬態(tài)的表達，并分析其與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，證實I-TAC—CXCR3及血管生成擬態(tài)在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)

11、移中的作用;(2)應(yīng)用RT-PCR和Westernblot檢測結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移細胞株中CXCR3及蛋白的表達水平:構(gòu)建表達CXCR3的質(zhì)粒載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，進而檢測I-TAC—CXCR3對腫瘤細胞體外增殖、遷移能力及侵襲能力的影響。若實驗證實肝轉(zhuǎn)移組與無肝臟轉(zhuǎn)移組結(jié)腸癌中I-TAC—CXCR3及血管生成擬態(tài)表達差異，且與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、分化程度等臨床病理參數(shù)具有相關(guān)性;而且證實I-TAC—CXCR3通過血管生成擬態(tài)誘導結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)

12、移是其機制之一。那么，應(yīng)用I-TAC—CXCR3及血管生成擬態(tài)對腫瘤進行檢測，就建立了結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的預(yù)測機制，沉默CXCR3為在結(jié)腸癌可能轉(zhuǎn)移的早期進行干預(yù)、進一步降低轉(zhuǎn)移率提供理論支持。
　　 二.研究目的：
　　 1.臨床研究方面:應(yīng)用免疫組化方法檢測結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移病人結(jié)腸腫瘤和肝臟轉(zhuǎn)移瘤的I-TAC—CXCR3表達;應(yīng)用PAS染色/CD31雙重染色檢測結(jié)腸癌組織血管生成擬態(tài)的表達，并分析其與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，

13、證實I-TAC—CXCR3及血管生成擬態(tài)在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移中的作用;
　　 2.細胞研究方面:應(yīng)用RT-PCR和Westernblot檢測結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移細胞株中CXCR3及蛋白的表達水平;構(gòu)建表達CXCR3的質(zhì)粒載體，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，進而檢測I-TAC—CXCR3對腫瘤細胞體外增殖、遷移能力及侵襲能力的影響。
　　 三.研究方法：
　　 (1)臨床研究
　　 1.收集結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移所行結(jié)腸癌根治合并肝轉(zhuǎn)移瘤切

14、除病人22例;選取20例結(jié)腸癌無肝轉(zhuǎn)移為對照組。收集結(jié)腸癌及肝轉(zhuǎn)移瘤組織。所有標本取材后分別保存。
　　 2.免疫組織化學測定I-TAC—CXCR3在結(jié)腸癌組織、肝轉(zhuǎn)移瘤組織中的表達。
　　 3.應(yīng)用PAS及CD31雙重染色檢測結(jié)腸癌組織中血管生成擬態(tài)的表達，PAS染色陽性、CD31抗體檢測陰性為血管生成擬態(tài)形成。
　　 (2)細胞研究
　　 1.CXCR3質(zhì)粒載體的構(gòu)建和鑒定，轉(zhuǎn)染至腫瘤細胞和表達檢測:

15、從人結(jié)腸癌組織中提取總RNA，采用RT-PCR方法得到全長CXCR3cDNA片段，并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染腫瘤細胞，經(jīng)篩選后應(yīng)用PCR進行鑒定。
　　 2.實驗分組:(1)pEGFP組;(2)CXCR3組;(3)pEGFP+I-TAC組;(4)CXCR3+I-TAC組
　　 3.應(yīng)用RT-PCR和Westernblot檢測結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移細胞株中CXCR3mRNA及蛋白的表達水平。
　　 4.從體外細胞模型觀察I-TAC的存在與否

16、對CXCR3細胞和pEGFP細胞增殖、定向遷移及侵襲能力的差異，探討I-TAC-CXCR3結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移細胞增殖、定向遷移和侵襲中的作用。
　　 四.研究結(jié)果：
　　 （一）臨床研究:
　　 結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移組共22例病人（每例取結(jié)腸癌及肝轉(zhuǎn)移病灶組織各一塊），共44個組織樣本。結(jié)腸癌無肝轉(zhuǎn)移組共20例病人（每例取結(jié)腸癌組織各一塊），共20個組織樣本。
　　 1.CXCR3在42例結(jié)腸癌組織中表達:肝轉(zhuǎn)移組16

17、例陽性表達，陽性率72.72％,
　　 6例陰性表達，無肝轉(zhuǎn)移組7例陽性表達，陽性率35％，13例陰性表達。與無肝轉(zhuǎn)移組比較差異有統(tǒng)計學意義(x2＝6.019，P＝0.014)。
　　 2.I-TAC在42例結(jié)腸癌組織中表達:肝轉(zhuǎn)移組19例陽性表達，陽性率86.36％,
　　 3例陰性表達，無肝轉(zhuǎn)移組9例陽性表達，陽性率45.00％，11例陰性表達。與無肝轉(zhuǎn)移組比較差異有統(tǒng)計學意義(x2＝8.066，P＝0.00

18、5)。
　　 3.肝轉(zhuǎn)移組CXCR3在22例結(jié)腸癌組織及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達:結(jié)腸癌組織中有16例表達陽性，陽性率72.72％，6例陰性表達，肝轉(zhuǎn)移癌組織中16例陽性表達，陽性率72.72％，6例陰性表達。兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(x2＝0.000，P＝1.000)。
　　 4.肝轉(zhuǎn)移組ITAC在結(jié)腸癌組織及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達:結(jié)腸癌組織中有19例表達陽性，陽性率86.36％，3例陰性表達，肝轉(zhuǎn)移癌組織中19例陽性

19、表達，陽性率86.36％，3例陰性表達。兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(x2＝0.000，P＝1.000)。
　　 5.結(jié)腸癌細胞中VM的表達:VM在22例肝轉(zhuǎn)移組結(jié)腸癌組織中有14例陽性表達，陽性率為63.63％，8例陰性表達。無肝轉(zhuǎn)移組結(jié)腸癌組織中有5例陽性表達，陽性率為25.00％，15例陰性表達，與無肝轉(zhuǎn)移組比較差異有統(tǒng)計學意義（x2＝6.313，P＝0.012）。
　　 6.分析42例入組病人實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)23例CX

20、CR3陽性病例中ITAC均為陽性;19例VM陽性病例中CXCR3均為陽性。統(tǒng)計結(jié)果進行配對資料的相關(guān)性分析，CXCR3與ITAC兩者陽性表達呈正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)r＝0.614，P＜0.001），血管生成擬態(tài)(VM)與CXCR3兩者陽性表達呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r＝0.637，P＜0.001)。（詳見表6、7）
　　 7.CXCR3表達與結(jié)腸癌組織臨床病理特征的關(guān)系:CXCR3陽性表達主要定位于細胞膜，少數(shù)表達于細胞漿和細胞核。按CXC

21、R3陽性細胞率和著色強度對結(jié)腸癌標本進行記分，結(jié)果顯示CXCR3在結(jié)腸癌組織中的表達水平不一，CXCR3的高表達與結(jié)腸癌患者的年齡、性別、結(jié)腸癌組織分化程度無關(guān)，而與肝臟、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　 （二）細胞研究:
　　 1.CXCR3蛋白表達情況:在培養(yǎng)的原代結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移細胞株中CXCR3基因表達陽性，并可以在蛋白質(zhì)水平上被檢測到。三組細胞（細胞組pGFP-CXCR3;pGFP;未轉(zhuǎn)化的QBC939細胞）均有CXCR3基

22、因在RNA水平上的陽性表達，且RNA量上的規(guī)律是:細胞組pGFP-CXCR3＞細胞組pGFP＞自細胞組未轉(zhuǎn)化的QBC939細胞。但差異無統(tǒng)計學意義，很有可能蛋白CXCR3的表達量是更多的受到翻譯后調(diào)控。
　　 2.I-TAC—CXCR3對腫瘤細胞體外貼壁增殖的影響（WST-1法）
　　 在同樣的體外培養(yǎng)條件下，細胞組pGFP-CXCR3體外貼壁增殖能力是三個細胞組中最強的;其次為未轉(zhuǎn)化QBC939細胞;最差的為轉(zhuǎn)化pGF

23、P的細胞組。
　　 3.I-TAC—CXCR3對腫瘤細胞體外遷移能力的影響
　　 在同時有CXCR3蛋白和ITAC蛋白的體外培養(yǎng)的條件下QBC939的體外遷徙能力最強，在缺乏CXCR3和ITAC蛋白的體外培養(yǎng)條件下，細胞QBC939的體外遷徙能力最弱。
　　 4.Transwell遷移實驗檢測情況:pGFP-CXCR3結(jié)腸癌細胞組在趨化作用下發(fā)生體外遷移細胞明顯增多，pGFP結(jié)腸癌細胞組體外遷移則明顯少。

24、　　 五.研究結(jié)論:
　　 （一）臨床研究
　　 1.I-TAC-CXCR3在結(jié)腸癌及肝轉(zhuǎn)移瘤中高表達，支持I-TAC-CXCR3與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。I-TAC-CXCR3信號轉(zhuǎn)導通路可能在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移過程中起一定作用.
　　 2.結(jié)腸癌組織中存在血管生成擬態(tài)。在肝轉(zhuǎn)移組結(jié)腸癌組織中血管生成擬態(tài)高表達，說明血管生成擬態(tài)與肝轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。
　　 3.CXCR3與血管生成擬態(tài)陽性表達呈正相關(guān)，I-TAC

25、-CXCR3可能誘導了血管生成擬態(tài)形成。
　　 （二）細胞研究
　　 1.本實驗從原代的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移細胞株檢測到CXCR3基因在RNA水平和蛋白質(zhì)水平上都有表達。
　　 2.利用SMARTRACE的方法調(diào)取CXCR3基因，得到全長cDNA并構(gòu)建載體pGFP-CXCR3和pGFP。成功轉(zhuǎn)化QBC939細胞得到細胞株pGPF-CXCR3和細胞株pGPF-CXCR3。
　　 3.通過Real-timePCR法檢

26、測，結(jié)果表明三組細胞都有CXCR3基因在RNA水平上的表達，且RNA量上的規(guī)律是:細胞組pGFP-CXCR3＞細胞組pGFP＞自細胞組未轉(zhuǎn)化的QBC939細胞，但差異無統(tǒng)計學意義。很有可能蛋白CXCR3的表達量是更多的受到翻譯后調(diào)控。
　　 4.WST-1法檢測細胞體外貼壁增殖能力。在同樣的體外培養(yǎng)條件下，細胞組pGPF-CXCR3體外貼壁增殖能力是三個細胞組中最強的;其次為未轉(zhuǎn)化QBC939細胞;最差的為轉(zhuǎn)化pGFP的細胞組。

27、說明趨化因子受體CXCR3對細胞貼壁增殖起促進作用。
　　 5.Transwell實驗表明趨化因子受體CXCR3對細胞的侵襲能力有促進作用。
　　 6.另一組實驗表明在同時有CXCR3蛋白和ITAC蛋白的體外培養(yǎng)的條件下QBC939的體外遷徙能力最強，在缺乏CXCR3和ITAC蛋白的體外培養(yǎng)條件下，細胞QBC939的體外遷徙能力最弱。本實驗從一定角度說明受體蛋白CXCR3和趨化因子ITAC之間的互做對細胞的遷徙能力增強有

28、促進作用。
　　 （三）小結(jié)
　　 通過本實驗研究，我們應(yīng)用免疫組織化學方法測定I-TAC—CXCR3在結(jié)腸癌及肝轉(zhuǎn)移組織呈高表達，應(yīng)用PAS/CD31雙重染色測定肝轉(zhuǎn)移組結(jié)腸癌組織中血管生成擬態(tài)成高表達，同時培養(yǎng)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移細胞株，從體外細胞模型證實了I-TAC-CXCR3對結(jié)腸癌細胞增殖、定向遷移及侵襲能力有促進作用。所得數(shù)據(jù)通過統(tǒng)計學處理，分析結(jié)果，由此我們認為I-TAC—CXCR3通過血管生成擬態(tài)誘導結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移