P2X4、NALP3表達(dá)變化與糖尿病腎病腎間質(zhì)炎癥損傷的關(guān)系.pdf

1、糖尿病腎病(Diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病最常見且最嚴(yán)重的并發(fā)癥，是導(dǎo)致終末期腎衰竭的主要原因。近年研究表明，炎癥在糖尿病腎病發(fā)病中具有重要作用。白介素1(Interleukin1，IL-1)家族細(xì)胞因子包括IL-1β、IL-18、IL-33等，是重要的促炎細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)感染、應(yīng)激、組織損傷等引起的免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，DKD患者腎間質(zhì)中活性IL-1β、IL-18等促炎細(xì)胞因子明顯增加，提示這些炎癥細(xì)

2、胞因子可能參與DKD的發(fā)生發(fā)展，但DKD時(shí)這些促炎細(xì)胞因子是如何產(chǎn)生并且活化的機(jī)制并不清楚。
　　 目前認(rèn)為，IL-1家族細(xì)胞因子前體分子活化后才能發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，而這一活化過程必須依靠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)的剪切作用才能完成，NALP3(Cryopyrin)是NALP3炎性體最重要的的組成部分之一，屬于NLRs(NOD like receptors，NLRs)家族成員，負(fù)責(zé)識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)，活化Caspas

3、e-1，剪切IL-1家族前體，使之成為有活性的促炎細(xì)胞因子如IL-1β、IL-18、IL-33等，進(jìn)而引起一系列的炎癥反應(yīng)。
　　 近年來NALP3在腎臟疾病中的病理生理作用已開始受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)小鼠腎臟缺血再灌注(I/R)模型中，NALP3-/-和ASC-/-小鼠腎組織炎癥反應(yīng)和腎功能損傷顯著減輕，小鼠死亡率顯著降低；在單側(cè)輸尿管梗阻模型中，NALP3炎性體活化與IL-1β產(chǎn)生增加相關(guān)，提示NALP3在非免疫因素介導(dǎo)的腎組織

4、炎癥反應(yīng)中具有重要作用；最近研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)NALP3-/-小鼠胰島β細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β顯著降低，推測腎臟NALP3炎性體是否參與了高糖刺激腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-1β、IL-18等，進(jìn)而引起腎間質(zhì)炎癥損害，而腎小管上皮細(xì)胞如何將高糖刺激信號(hào)傳遞到胞漿內(nèi)進(jìn)而激活NALP3炎性體尚不清楚。
　　 研究報(bào)道，ROS抑制劑APDC或NADPH氧化酶抑制物DIP均可抑制高糖激活胰島β細(xì)胞NALP3炎性體及IL-1β的產(chǎn)生；格列本脲通過

5、抑制細(xì)胞內(nèi)K+外流而抑制高糖對NALP3炎性體的激活作用，提示氧應(yīng)激和細(xì)胞內(nèi)低鉀可能是高糖激活胰島β細(xì)胞NALP3炎性體的重要途徑。P2Xs(Purinergic receptor X，P2Xs)是以核苷酸為激動(dòng)劑的離子通道型嘌呤受體，當(dāng)細(xì)胞外刺激信號(hào)(如ATP)作用于效應(yīng)細(xì)胞時(shí)P2Xs發(fā)生構(gòu)象變化，促進(jìn)細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流和鉀離子外流，引起細(xì)胞內(nèi)低鉀；P2Xs還介導(dǎo)ATP引起的巨噬細(xì)胞ROS產(chǎn)生和IL-1β等炎癥細(xì)胞因子釋放，但目前未見高

6、糖通過激活P2Xs活化NALP3的文獻(xiàn)報(bào)道。由于P2Xs激活的下游事件如細(xì)胞內(nèi)低鉀和ROS增多，均是NALP3炎性體活化途徑中的重要環(huán)節(jié)，并且P2Xs的重要成員P2X4在腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞都有表達(dá)，此外，高糖負(fù)荷和ATP可上調(diào)系膜細(xì)胞P2X4表達(dá)參與糖尿病腎病腎小球硬化的發(fā)生，因此我們推測，腎小管上皮細(xì)胞可能通過P2X4感受高糖信號(hào)的刺激而激活NALP3炎性體，促進(jìn)活性IL-1β和IL-18等的產(chǎn)生，進(jìn)而引起腎小管間質(zhì)炎癥反

7、應(yīng)，放大高糖引起的炎癥反應(yīng)瀑布，最終導(dǎo)致糖尿病腎病腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)。為此，本課題針對DKD患者腎小管上皮細(xì)胞P2X4、NALP3、IL-1β、IL-18的表達(dá)規(guī)律及其變化關(guān)系進(jìn)行了研究，為下一步研究其機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，旨在為揭示糖尿病腎病腎小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)的機(jī)制提供新的科學(xué)依據(jù)。
　　 一、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1.研究對象及分組根據(jù)1999年WHO、IDF公布的糖尿病以及Mogensen糖尿病腎病診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，選取2010年

8、9月至2011年10月第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院腎臟內(nèi)科收治的經(jīng)臨床和腎活檢確診為2型糖尿病腎病病例30例(尿蛋白>500mg/d或SCr>120μmol/L)，其中男性12例，女性18例，年齡40-68歲，(平均47.93±7.05歲)；對照組為泌尿外科腎臟錯(cuò)構(gòu)瘤切除術(shù)或腎移植術(shù)病例(尿蛋白<500 mg/d或SCr<120μmol/L)10例，其中男性6例，女性4例，年齡40-65歲，(平均50.60±9.40歲)，并留取腎錯(cuò)構(gòu)瘤切除后或

9、腎移植術(shù)后經(jīng)病理診斷為正常的腎組織。所有對象均排除糖代謝異常、吸煙、高血壓、肥胖等干擾因素。
　　 收集標(biāo)本時(shí)均取得患者本人及家屬的知情同意，所選患者均排除糖尿病急性并發(fā)癥、泌尿系感染、嚴(yán)重心、肝、腎功能不全、以及風(fēng)濕病、惡性腫瘤等系統(tǒng)性疾病。
　　 2.檢測指標(biāo)及方法
　　 于術(shù)前收集對照組患者血、尿標(biāo)本，腎活檢前一天收集DKD患者的血、尿標(biāo)本，常規(guī)生化方法檢測血清總膽固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白膽固醇(LDL

10、)、空腹血糖、24小時(shí)尿蛋白定量、血清肌酐(SCr)，測量收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、計(jì)算體重指數(shù)(BMI)、估算腎小球?yàn)V過率(eGFR)，按照Cockcroft-Gault計(jì)算公式：eGFR(mL/min per1.73 m2)=(140-age)×BW(kg)/[72×Scr(mg/dl)]×0.85(if female)；免疫組化方法檢測對照組及DKD組腎小管上皮細(xì)胞P2X4、NALP3、IL-1β及IL-18的表達(dá)變化規(guī)

11、律；激光共聚焦技術(shù)檢測P2X4、NALP3、IL-1β及IL-18的表達(dá)變化關(guān)系；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測兩組患者尿液中IL-1β、IL-18的水平。
　　 一、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1.一般情況
　　 與對照組相比，DKD組患者24小時(shí)尿微量白蛋白、空腹血糖、SBP、DBP、總膽固醇、LDL膽固醇、甘油三酯及BMI顯著增高(P<0.05)，eGFR顯著降低(P<0.05)。
　　 2.NALP3、I

12、L-1β、IL-18在腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)情況及其與腎間質(zhì)損傷的相關(guān)性
　　 免疫組化結(jié)果顯示對照組腎小管上皮細(xì)胞胞漿NALP3呈低水平的表達(dá)，IL-1β、IL-18基本不表達(dá)；DKD組患者腎小管上皮細(xì)胞胞漿NALP3、IL-1β、IL-18表達(dá)顯著增加(P<0.05)；相關(guān)分析表明：DKD患者腎小管上皮細(xì)胞NALP3、IL-1β、IL-18表達(dá)與腎間質(zhì)炎癥呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.66，r=0.55，r=0.83，P<0.01

13、)、與腎間質(zhì)纖維化呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.65，r=0.50，r=0.81，P<0.01)、與腎小管萎縮呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.63，r=0.56，r=0.82，P<0.01)，與eGFR呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.73，r=-0.65，r=-0.58，P<0.01)；激光共聚焦結(jié)果顯示DKD組患者NALP3與IL-1β、IL-18分別共表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿。
　　 3.P2X4在腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)情況及其與腎間質(zhì)損傷

14、的相關(guān)性
　　 免疫組化結(jié)果顯示對照組腎小管上皮細(xì)胞胞漿P2X4呈低水平的表達(dá)，DKD組患者腎小管上皮細(xì)胞胞漿P2X4表達(dá)顯著增加(P<0.05)；相關(guān)分析表明：DKD患者腎小管上皮細(xì)胞P2X4與腎間質(zhì)炎癥呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.82，P<0.01)，與腎間質(zhì)纖維化呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.80，P<0.01)，與腎小管萎縮呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.80，P<0.01)，與eGFR呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.58，P<0.01

15、)；激光共聚焦結(jié)果顯示DKD組患者P2X4與NALP3、IL-1β、IL-18分別共表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿。
　　 4.ELISA檢測尿中IL-1β、IL-18水平變化
　　 結(jié)果顯示，DKD患者尿IL-1β、IL-18水平較對照組顯著增高(P<0.05)。
　　 三、結(jié)論
　　 1.DKD患者腎小管上皮細(xì)胞P2X4、NALP3、IL-1β、IL-18表達(dá)與腎間質(zhì)損傷及腎功能改變的相關(guān)性表明腎間質(zhì)炎癥反