脂聯素抑制胰島β細胞脂性調亡及其機制研究.pdf

1、第一部分胰島β細胞的脂性凋亡及其機制
　　 目的:證實脂毒性誘導胰島β細胞凋亡;探討脂毒性誘導β細胞凋亡的途徑。
　　 方法:體外培養(yǎng)胰島β細胞，隨機化分為:
　　 ①正常對照組(BSA):含0.5％BSA的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時。②棕櫚酸組(PA):加入0.4mmol/l的棕櫚酸(含0.5％BSA)培養(yǎng)24小時。③油酸脂組(OA):加入0.4mmol/l的油酸脂(含0.5％BSA)培養(yǎng)24小時。④Z-LEH

2、D-FMK組(LEHD):40uM Z-LEHD-FMK預孵2小時后，加入0.4mmol/l的棕櫚酸(含0.5％BSA)培養(yǎng)24小時。⑤Z-IETD-FMK組（IETD）:40uM Z-IETD-FMK預孵2小時后，加入0.4mmol/l的棕櫚酸(含0.5％BSA)培養(yǎng)24小時。⑥Z-LEHD-FMK聯合Z-IETD-FMK(LEHD/IETD)組:40uM Z-LEHD-FMK及40uMZ-IETD-FMK聯合預孵2小時后，加入0.4

3、mmol/l的棕櫚酸(含0.5％BSA)培養(yǎng)24小時。
　　 采用Annexin V-Cy3凋亡試劑盒檢測細胞凋亡，Western blotting檢測Cleaved caspase-3、8、9蛋白的表達。
　　 結果:與對照組及油酸脂組比較，棕櫚酸組Cleaved caspase3的表達增加(p＜0.05)，凋亡細胞數目明顯增加(p＜0.01)，且內源性凋亡途徑的Cleaved caspase8(p＜0.05)及外源性

4、凋亡途徑的Cleaved caspase9表達也增加(p＜0.01)，而Cleaved caspase9的升高更顯著。使用Caspase抑制劑后發(fā)現，Z-LEHD-FMK（Caspase9抑制劑）顯著減少Cleavedcaspase3的表達(p＜0.05)，而Z-IETD-FMK（Caspase8抑制劑）對Cleaved caspase3的表達有減少趨勢，但沒有統(tǒng)計學意義。同時使用Z-LEHD-FMK（Caspase9抑制劑）及Z-IE

5、TD-FMK(Caspase8)不能完全抑制棕櫚酸誘導的Cleaved caspase3的表達。
　　 結論:脂毒性通過同時激活內源性及外源性凋亡途徑導致胰島β細胞凋亡，其中內源性凋亡途徑可能起著主要作用。脂毒性誘導的Cleaved caspase3激活中可能還存在非Caspase8及Caspase9的誘導因素。
　　 第二部分脂聯素抗脂性凋亡及其機制
　　 目的:證實脂聯素的抗凋亡特性;初步探討脂聯素抗脂性凋亡

6、的機制。
　　 方法:體外培養(yǎng)胰島β細胞，隨機分為①正常對照組(BSA):含0.5％BSA的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時。②棕櫚酸組(PA):加入0.4mmol/l的棕櫚酸(含0.5％BSA)培養(yǎng)24小時。③脂聯素組OA）:加入脂聯素預孵2小時后，加入0.4mmol/l的棕櫚酸(含0.5％BSA)培養(yǎng)24小時。
　　 采用Annexin V-Cy3凋亡檢測細胞凋亡情況，Western blotting檢測Cleaved c

7、aspase-3、8、9及Bax、Bcl-2蛋白的表達。
　　 結果:與單純棕櫚酸組比較，脂聯素預孵后Cleaved caspase3的表達減少、胰島β細胞凋亡數目減少(p＜0.01); Cleaved caspase9表達減少(p＜0.05);而Cleaved caspase8的表達有減少趨勢，但沒有統(tǒng)計學意義。脂聯素預孵后，Bax表達減少， Bcl-2表達增加(p＜0.05)。
　　 結論:脂聯素具有抗脂性凋亡的作用

8、，脂聯素對內源性及外源性凋亡途徑均有抑制作用，但對內源性凋亡途徑的抑制作用可能起著主要作用。脂聯素通過調節(jié)Bax、Bcl-2的表達抑制內源性凋亡途徑。
　　 第三部分表達小鼠脂聯素蛋白的重組慢病毒載體干預糖尿病
　　 目的:構建表達小鼠脂聯素的重組慢病毒載體;通過慢病毒載體提高血循環(huán)脂聯素濃度;探討提高血循環(huán)脂聯素濃度對糖尿病的干預作用。
　　 方法:構建表達小鼠全長脂聯素蛋白的重組慢病毒載體（攜帶綠色熒光蛋白）

9、。小劑量鏈脲菌素多次注射聯合高脂飲食喂養(yǎng)建立2型糖尿病小鼠模型。隨機分組:(1)正常對照組(Control):普通飲食喂養(yǎng)6周。(2)2型糖尿病組:小鼠禁食16小時后腹腔注射鏈尿菌素（55mg/kg體重，每天一次，連續(xù)5天），繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)4周。以隨機血糖濃度＞16.7mmol/L為糖尿病造模成功標準。4周后成膜的糖尿病小鼠隨機分為①生理鹽水注射組(Saline):尾靜脈注射生理鹽水100ul，繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)2周。②脂聯素干預組(P

10、lenti-Acdc-EGFP):尾靜脈注射表達小鼠脂聯素的重組慢病毒載體100ul，病毒滴度為1×108 ifu/ml，繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)2周。③空病毒載體注射組(Plenti-EGFP):尾靜脈注射空病毒載體100ul，繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)2周。
　　 采用熒光顯微鏡觀察肝臟綠色熒光表達情況;Western blotting檢測肝臟脂聯素蛋白的表達;Elisa法檢測血循環(huán)中脂聯素的水平;TUNEL法檢測胰島凋亡;免疫組化檢測Cle

11、aved caspase3、8、9的表達;化學法檢測血脂水平。指血糖儀檢測血糖水平。
　　 結果:小劑量多次鏈脲菌素注射聯合高脂飲食喂養(yǎng)法成功建立了2型糖尿病小鼠模型，其血脂、血糖水平明顯高于正常對照組(p＜0.01)。
　　 慢病毒尾靜脈注射14天后，肝組織冰凍切片，熒光顯微鏡下見大量綠色熒光表達于脂聯素干預組及空病毒載體注射組，而正常對照組及生理鹽水注射組未見綠色熒光表達。Western blotting顯示僅脂聯素

12、干預組見脂聯素蛋白表達。Elisa檢測結果顯示脂聯素干預組血脂聯素水平明顯高于其他三組(p＜0.01)，為48.03±3.79ug/ml，空病毒載體組與生理鹽水組水平相似，但顯著低于正常對照組(p＜0.05)。
　　 與正常對照組比較，生理鹽水注射組及空病毒注射組體重下降、血糖、血脂水平升高(p＜0.01)。生理鹽水注射組及空病毒注射組兩組間比較，沒有統(tǒng)計學差異意義。
　　 與生理鹽水注射組及空病毒注射組比較，脂聯素干預