小鼠放創(chuàng)復(fù)合傷傷口愈合延遲機(jī)理研究.pdf

1、放創(chuàng)復(fù)合傷主要見于腫瘤放療以及核輻射損傷等合并創(chuàng)傷的病人，其突出的問題是創(chuàng)面愈合延遲或經(jīng)久不愈?，F(xiàn)有研究表明：全身輻射損傷延緩創(chuàng)面愈合是以造血細(xì)胞和修復(fù)細(xì)胞數(shù)量與功能損害為關(guān)鍵環(huán)節(jié)的諸多愈合因素相互協(xié)同作用的結(jié)果[1]，其變化特點(diǎn)可能與創(chuàng)傷的損傷程度、輻射劑量及個(gè)體差異等因素密切相關(guān)[2-5]，目前發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。細(xì)胞因子是一類對(duì)細(xì)胞生長、分化有明顯調(diào)控作用的小分子生物活性多肽，是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間重要的信號(hào)傳導(dǎo)物。研究表明，血管

2、內(nèi)皮生長因子（Vascular EndotheliAlGrowth Factor，VEGF）、血小板源性生長因子（Platelet-derivedGrowth Factor，PDGF）、腫瘤壞死因子（Tumor Necrosis Factor-alpha，TNF-α）是創(chuàng)傷愈合中重要的信使分子及組織者，其在放創(chuàng)復(fù)合傷傷口愈合不同時(shí)期有明顯表達(dá)減弱的現(xiàn)象[6-8]。目前國內(nèi)外放創(chuàng)復(fù)合傷的研究多側(cè)重于通過動(dòng)物模型來闡明某種細(xì)胞因子在創(chuàng)傷愈合

3、過程中的功能，但由于文獻(xiàn)報(bào)道的放創(chuàng)復(fù)合傷動(dòng)物模型在放射劑量、動(dòng)物死亡率統(tǒng)計(jì)、創(chuàng)面延遲愈合程度認(rèn)識(shí)方面差異較大[2-5]，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)模型。放創(chuàng)復(fù)合傷口愈合是炎癥細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞、細(xì)胞因子以及細(xì)胞外基質(zhì)共同參與并高度協(xié)調(diào)相互調(diào)控的復(fù)雜過程[9]，不同劑量全身輻射對(duì)傷口中多基因表達(dá)的影響及多基因與炎癥細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞在創(chuàng)面愈合不同階段相互影響的協(xié)同關(guān)系尚未見相關(guān)報(bào)道。因此，構(gòu)建穩(wěn)定性、重復(fù)性好、標(biāo)準(zhǔn)化的放創(chuàng)復(fù)合傷動(dòng)物模型，分析 PDGF-BB

4、、VEGF和TNF-α等三種在組織修復(fù)中起主要作用的細(xì)胞因子在放創(chuàng)復(fù)合傷口難愈中的意義，并探討細(xì)胞因子與炎癥細(xì)胞，修復(fù)細(xì)胞之間的關(guān)系，對(duì)于研究全身輻射影響創(chuàng)傷愈合的機(jī)制是十分必要的。
　　 目的：
　　 構(gòu)建小鼠不同全身輻射劑量合并背部皮膚缺損模型、背部皮膚切割傷模型，檢測小鼠皮膚撕裂強(qiáng)度、皮膚缺損殘余面積、動(dòng)物體質(zhì)量變化和存活率及傷口組織中炎細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞、新生毛細(xì)血管等體現(xiàn)創(chuàng)傷整體傷情的相關(guān)指標(biāo)，分析 PDGF-BB

5、、VEGF、TNF-α在放創(chuàng)復(fù)合傷口中表達(dá)水平的變化，研究不同劑量全身輻射對(duì)皮膚創(chuàng)面愈合的影響，探討 PDGF-BB、VEGF和 TNF-α與炎細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞在放創(chuàng)復(fù)合傷愈合中的作用及關(guān)系，為深入認(rèn)識(shí)放創(chuàng)復(fù)合傷的難愈機(jī)制提供新的思路。
　　 方法：
　　 采用 250只健康昆明種小鼠（SPF級(jí))，雌性，體質(zhì)量（20±2）g；根據(jù)致傷方法不同分為背部皮膚切割傷組和背部皮部缺損組，兩組小鼠均以 60Coγ射線一次性均勻輻射

6、4、6 或 8 Gy為實(shí)驗(yàn)組，以未輻射的為對(duì)照組。致傷方法：切割傷組全層切開小鼠背部正中 3.5cm 長皮膚；皮膚缺損組在小鼠背部制作 1.5×1.5 cm 方形全層皮膚缺損傷口。切割傷組共計(jì)小鼠 70只，其中對(duì)照組 10只，4、6、8 Gy 實(shí)驗(yàn)組各 20只，于傷后 10d 每組處死 10只動(dòng)物，取傷口處全層皮膚組織條，利用生物力學(xué)方法測試傷口撕裂強(qiáng)度。皮膚缺損組共計(jì)小鼠 180只，其中對(duì)照組 30只，4、6、8 Gy實(shí)驗(yàn)組各 50只

7、，統(tǒng)計(jì) 14 d內(nèi)各組動(dòng)物體質(zhì)量變化和存活率；用透明薄膜描記傷后14d內(nèi)的皮膚缺損區(qū)殘余面積，掃描儀掃描透明薄膜后用 Image Pro plus v1.5 圖像分析軟件處理計(jì)算皮膚缺損區(qū)殘余面積值；分別于傷后 3 d、5 d、7 d、10d、14 d 每組處死 6只動(dòng)物，取材，HE 染色觀察傷口組織病理學(xué)及炎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、新生毛細(xì)血管數(shù)量的變化；免疫組織化學(xué)染色檢測小鼠皮膚傷口中 PDGF-BB、VEGF和 TNF-α蛋白的表達(dá)水

8、平。
　　 結(jié)果：
　　 1、小鼠背部皮膚切割傷組傷口撕裂強(qiáng)度檢測顯示：實(shí)驗(yàn)組傷口隨照射劑量增加，撕裂強(qiáng)度降低明顯。10d時(shí)，4 Gy 實(shí)驗(yàn)組傷口撕裂強(qiáng)度 （114.26±0.29） g，與對(duì)照組 （117.12±1.86） g 相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而 6 Gy 實(shí)驗(yàn)組 （91.87±1.96） g和 8Gy 實(shí)驗(yàn)組傷口撕裂強(qiáng)度 （55.26±2.64） g 均低于對(duì)照組（p＜0.05）。
　　 2、小鼠背部皮

9、膚缺損組存活率、體質(zhì)量變化及皮膚缺損區(qū)殘余面積檢測顯示：6Gy 實(shí)驗(yàn)組 8 d和 14 d的存活率分別為 73％和 55％，8 Gy 實(shí)驗(yàn)組 8 d時(shí)存活率僅 23％，至 10d 全部死亡。傷后 14 d內(nèi)，隨輻射劑量的增加，實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量較傷前降低程度愈加明顯。全身輻射對(duì)皮膚創(chuàng)面愈合延遲隨照射劑量增加而加重。6、8Gy 實(shí)驗(yàn)組傷后 2 d與對(duì)照組相比殘余面積即明顯增大，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P<0.01），4 Gy 實(shí)驗(yàn)組傷后 8 d與對(duì)

10、照組相比殘余面積增大差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 3、小鼠背部皮膚缺損組傷口主要細(xì)胞、血管定量計(jì)數(shù)分析發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組傷口炎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、新生毛細(xì)血管數(shù)量較單傷組都不同程度地降低，6、8 Gy 實(shí)驗(yàn)組傷后 3-5 d 創(chuàng)面的炎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管數(shù)量均明顯低于對(duì)照組（P<0.01）。傷后 3-7 d，4、6、8 Gy 實(shí)驗(yàn)組炎細(xì)胞數(shù)量的降低隨劑量增加而更加明顯，組間有顯著差異（P<0.01）。
　　

11、 4、組織病理學(xué)結(jié)果顯示：(1)小鼠背部皮膚切割傷組：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠傷口膠原纖維排列無序，組織疏松，成纖維細(xì)胞增殖較少；(2)小鼠背部皮膚缺損組：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠傷口早期炎癥反應(yīng)受抑，成纖維細(xì)胞和新生毛細(xì)血管數(shù)量增多明顯滯后，肉芽組織形成延遲，上皮覆蓋滯后。
　　 5、小鼠背部皮膚缺損組免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：全身輻射使傷口愈合各階段滯后、延長。（1）傷后3-7 d，對(duì)照組和 6、8 Gy 實(shí)驗(yàn)組 PDGF-BB

12、、VEGF表達(dá)逐漸增強(qiáng)，傷后 7 d表達(dá)至峰值，6、8 Gy 實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組表達(dá)強(qiáng)度均降低，未能形成表達(dá)峰值；傷后 10d，對(duì)照組 PDGF-BB、VEGF的表達(dá)明顯減弱，6 Gy 實(shí)驗(yàn)組表達(dá)略有減弱，但表達(dá)強(qiáng)度強(qiáng)于對(duì)照組。（2）傷后 3-5 d，對(duì)照組和 6、8 Gy 實(shí)驗(yàn)組TNF-α表達(dá)逐漸增強(qiáng)，6、8 Gy 實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組表達(dá)強(qiáng)度均降低，對(duì)照組傷后 5 d表達(dá)至峰值；傷后 7 d，對(duì)照組 TNF-α的表達(dá)強(qiáng)度開始減弱，6、8 Gy

13、 實(shí)驗(yàn)組表達(dá)仍持續(xù)增強(qiáng)，表達(dá)水平的增加較對(duì)照組延遲。（3）定量結(jié)果表明：6、8 Gy 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比：傷后 3-7 d PDGF-BB、VEGF的積分光密度（IOD）值明顯減少（P<0.05)；
　　 傷后3-5 d TNF-α的IOD值均明顯減少（P<0.05）。6 Gy 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比：傷后 10d PDGF-BB、VEGF的IOD值明顯增加（P<0.05）；傷后7-10d TNF-α的IOD值均明顯增加（P<0.0

14、5)。6、8 Gy 實(shí)驗(yàn)組（傷后 3-7 d）傷口內(nèi) PDGF-BB、VEGF、TNF-α的IOD值組間相比有顯著差異（P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1、放創(chuàng)復(fù)合傷傷口愈合延遲與輻射劑量存在明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。全身輻射合并切割傷時(shí)，傷口撕裂強(qiáng)度隨輻射劑量增高而降低；全身輻射合并皮膚缺損傷時(shí)動(dòng)物模型整體傷情和傷口愈合延緩效應(yīng)隨輻射劑量增大而加重。
　　 2、小鼠6 Gy 60Coγ射線全身放射合并背部皮膚切

15、割傷模型、背部皮膚缺損模型，可為放創(chuàng)復(fù)合傷難愈機(jī)制的研究和早期的實(shí)驗(yàn)治療提供研究平臺(tái)。
　　 3、全身放射合并皮膚缺損傷愈合早期階段（傷后 7d內(nèi)）傷口內(nèi) PDGF-BB、VEGF和（傷后 5 d內(nèi)）傷口內(nèi) TNF-α表達(dá)水平的降低，表達(dá)時(shí)間滯后，可能是放創(chuàng)復(fù)合傷傷口愈合延遲的重要原因之一。
　　 4、不同劑量全身輻射對(duì)炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的影響打亂了創(chuàng)面修復(fù)中細(xì)胞與細(xì)胞因子之間生理性調(diào)節(jié)過程。放創(chuàng)復(fù)合傷創(chuàng)面愈合不同階段