MicroRNA-1在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)和調(diào)控作用及其潛在診斷價(jià)值研究.pdf

1、食管癌是世界上常見的第八大惡性腫瘤，目前中國(guó)食管癌發(fā)病率為19.34/10萬，在癌癥新發(fā)病例構(gòu)成中位居第6位，占全部癌癥發(fā)病的7.27％。食管癌死亡率為15.39/10萬，占全部癌癥死亡總數(shù)的8.96%，在癌癥死亡原因中列第4位。根據(jù)食管癌的組織學(xué)特點(diǎn)可分為五種類型，其中食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）所占比例最多，大約占90%，食管腺癌（esophageal adeno

2、carcinoma, EA）次之，占7%左右，其他幾種類型均少見。由于早期癥狀不明顯，缺乏及時(shí)發(fā)現(xiàn)和早期診斷的有效方法，臨床上首次確診的食管鱗癌患者80%以上為中、晚期，其5年生存率不及20%，預(yù)后極差。因此，對(duì)患者進(jìn)行早診斷、早治療以及尋找診斷食管癌有效的分子生物學(xué)標(biāo)記意義重大。
　　微小RNA（microRNA, miRNA, miR）是一類長(zhǎng)度為19-24個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA，通過與靶基因的3’UTR區(qū)特異性結(jié)合

3、抑制靶基因 mRNA翻譯或?qū)⑵浣到?，從而在轉(zhuǎn)錄后水平起到基因沉默效應(yīng)，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生理功能，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等密切聯(lián)系。MiR-1由miR-1-133表達(dá)簇編碼，其分別位于第18（18q11）和20（20q13）常染色體上，為成熟miR-1和miR-133編碼。miR-1最初作為肌特異性miRNA在心肌和骨骼肌中發(fā)現(xiàn)，參與心肌和骨骼肌的生成。最近研究發(fā)現(xiàn)，miR-1在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用。研究表明，miR-

4、1在多種腫瘤中異常表達(dá)，如在結(jié)腸癌、膀胱癌與腎癌中都表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因的作用，但其表達(dá)與食管鱗癌臨床病理資料及其可能作用機(jī)制的研究少有報(bào)道。
　　有多項(xiàng)研究證實(shí)，肌動(dòng)蛋白骨架蛋白1（LIM和SH3蛋白1，LIM and SH3 protein1, LASP1）和肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白2（Transgelin-2，曾譯為轉(zhuǎn)膠蛋白）在多種惡性腫瘤的增殖、侵襲和發(fā)展過程中起非常重要作用，并證明他們是miR-1的靶基因，而此兩種癌基因在食管

5、鱗癌方面的研究少見報(bào)道且其與miR-1在食管鱗癌中的關(guān)系也未見報(bào)道。
　　本研究采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（ quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測(cè)miR-1在食管鱗癌組織和其配對(duì)正常組織中的表達(dá)，深入分析miR-1的表達(dá)水平與食管鱗癌患者臨床病理關(guān)系。同時(shí)進(jìn)行miR-1的過表達(dá)或沉默，并通過MTT實(shí)驗(yàn)

6、、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡和周期、Transwell實(shí)驗(yàn)，研究其對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株Eca109增殖、凋亡和周期、遷移和侵襲能力的影響，利用雙熒光素酶報(bào)告基因分析檢測(cè)miR-1對(duì)其預(yù)測(cè)靶基因LASP1和TAGLN2的靶向作用。同時(shí)檢測(cè)食管鱗癌組織和其配對(duì)正常組織中LASP1和TAGLN2的表達(dá)情況，分析其與miR-1表達(dá)水平的關(guān)系。并在最后探討了血漿miR-1作為腫瘤標(biāo)記物的可能性。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　第一部分 miR-1、LAS

7、P1和TAGLN2在食管鱗癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征關(guān)系的研究
　　目的：通過檢測(cè)miR-1、LASP1和TAGLN2在食管鱗癌組織和配對(duì)正常組織中的表達(dá)，探討其在食管鱗癌中的表達(dá)情況及其與食管鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系。
　　方法：采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)miR-1在55例食管鱗癌組織和配對(duì)正常組織中的表達(dá)，回顧性分析其表達(dá)水平與食管鱗癌患者的臨床病理特征關(guān)系。食管鱗癌患者的臨床病理特征包括患者年齡、性別、腫瘤位置、腫

8、瘤TNM分期、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及脈管瘤栓情況等。選擇與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的癌基因LASP1和TAGLN2，分別采用qRT-PCR和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)其在食管鱗癌組織和配對(duì)正常組織的表達(dá)水平，探討其表達(dá)水平與食管鱗癌患者的臨床病理特征關(guān)系。另外，分析了miR-1與癌基因LASP1和TAGLN2的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1 miR-1在食管鱗癌組織和配對(duì)正常組織中的表達(dá)水平。
　　應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)55例食管鱗癌

9、組織和配對(duì)正常組織中miR-1的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中miR-1的表達(dá)水平低于相應(yīng)的癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2 miR-1的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征間的關(guān)系。
　　55例食管鱗癌患者中，miR-1的相對(duì)表達(dá)水平與食管鱗癌患者的年齡、性別、腫瘤位置和腫瘤大小無明顯關(guān)系（P＞0.05），而與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)和脈管瘤栓等有關(guān)（ P=0.002， P=0.000， P

10、=0.022）。
　　3 LASP1和TAGLN2在食管鱗癌組織和配對(duì)正常組織中的表達(dá)水平。
　　采用 qRT-PCR和免疫組化法檢測(cè)與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的癌基因LASP1和TAGLN2在55例食管鱗癌組織和配對(duì)正常組織中的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌組織中LASP1和TAGLN2的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)的癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　4 LASP1和TAGLN2的表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征

11、間的關(guān)系。
　　55例食管鱗癌患者中，LASP1和TAGLN2的相對(duì)表達(dá)水平與食管鱗癌患者的年齡、性別、腫瘤位置和腫瘤大小無明顯關(guān)系（P＞0.05），而與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)和脈管瘤栓等有關(guān)（ P=0.000， P=0.000，P=0.008和P=0.000，P=0.001，P=0.008）。
　　5食管鱗癌組織中miR-1與LASP1和TAGLN2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　經(jīng)Spearman秩相關(guān)性檢驗(yàn)分析發(fā)

12、現(xiàn)，在LASP1低表達(dá)的食管鱗癌組織標(biāo)本（24例）中，miR-1高表達(dá)的標(biāo)本占66.7%（16例/24例）；而LASP1高表達(dá)的標(biāo)本（31例）中，miR-1低表達(dá)的標(biāo)本占87.1%（27例/31例）；miR-1與LASP1蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.45，P＜0.05）。在TAGLN2低表達(dá)的食管鱗癌組織標(biāo)本（24例）中，miR-1高表達(dá)的標(biāo)本占50.0%（12例/24例）；而TAGLN2高表達(dá)的標(biāo)本（31例）中，miR-1低表達(dá)的

13、標(biāo)本占74.2%（23例/31例）；miR-1與TAGLN2蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r＝-0.382，P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1 miR-1在食管鱗癌組織中表達(dá)顯著低于配對(duì)正常組織，而 LASP1和TAGLN2在食管鱗癌組織中表達(dá)顯著高于配對(duì)正常組織。
　　2 miR-1、LASP1和TAGLN2在食管鱗癌組織中的表達(dá)與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)和脈管瘤栓等有關(guān)。
　　3 miR-1與癌基因

14、LASP1和 TAGLN2存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示miR-1可能在食管鱗癌的侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用。
　　第二部分 miR-1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：研究miR-1對(duì)于食管鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和周期、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。
　　方法：體外轉(zhuǎn)染miR-1模擬物或是抑制物或其陰性對(duì)照，通過MTT、流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)在體外觀察 miR-1在食管鱗癌細(xì)胞Eca109增

15、殖、凋亡和周期、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用。
　　結(jié)果：
　　1 miR-1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞增殖能力的影響。
　　MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，食管鱗癌細(xì)胞在24 h、48 h、72 h細(xì)胞增殖率 mimics-miR-1組與 mimics-miR-1 control組比較降低，而inhibitor-miR-1組與inhibitor-miR-1 control組比較增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

16、，表明miR-1對(duì)食管鱗癌細(xì)胞增殖具有抑制作用。
　　2 miR-1對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞凋亡與周期的影響。
　　流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染48h后， mimics-miR-1組與mimics-miR-1 control組比較和inhibitor-miR-1組與inhibitor-miR-1 control組比較，Eca109細(xì)胞在凋亡率和細(xì)胞周期方面未發(fā)生明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

17、>　　3 miR-1對(duì)人食管鱗癌細(xì)胞株Eca109細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　Transwell分析結(jié)果顯示，mimics-miR-1組與mimics-miR-1 control組相比，mimics-miR-1組Eca109細(xì)胞遷移和侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)明顯少于mimics-miR-1 control組（P＜0.05），說明其遷移和侵襲能力明顯減弱；inhibitor-miR-1組與 inhibitor-miR-1 control組比

18、較，inhibitor-miR-1組Eca109細(xì)胞下室的細(xì)胞數(shù)明顯增多，說明其遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說明miR-1基因能夠影響Eca109細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
　　結(jié)論：miR-1可抑制食管鱗癌細(xì)胞Eca109的增殖、遷移和侵襲能力，而對(duì)細(xì)胞凋亡和周期無影響。
　　第三部分 miR-1調(diào)控LASP1和TAGLN2表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究
　　目的：探討食管鱗癌中miR-

19、1對(duì)于LASP1和TAGLN2表達(dá)的相關(guān)調(diào)控關(guān)系。
　　方法：運(yùn)用 MicroRNA生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件，對(duì)其可能的作用靶序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)合miR-1在食管鱗癌細(xì)胞中發(fā)揮的生物學(xué)功能，進(jìn)行進(jìn)一步篩選。通過雙熒光素酶報(bào)告基因分析的方法檢測(cè)miR-1對(duì)其預(yù)測(cè)靶基因LASP1和TAGLN2的靶向作用，采用Western-blot驗(yàn)證食管鱗癌細(xì)胞株Eca109中miR-1對(duì)其預(yù)測(cè)靶基因表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1生物信

20、息學(xué)軟件預(yù)測(cè)靶基因，并雙熒光素酶驗(yàn)證 miR-1對(duì)LASP1和TAGLN2的靶向作用。
　　生物信息學(xué)軟件 TargetScan預(yù)測(cè)結(jié)果提示，miR-1序列可以分別與LASP1和TAGLN2 mRNA的3’-UTR區(qū)相結(jié)合，其兩者可能為miR-1的靶基因。
　　我們進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)了miR-1與LASP1和TAGLN2基因 mRNA3’-UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)的活性。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染mimics-miR-1后能夠

21、顯著降低食管鱗癌細(xì)胞Eca109中LASP1和TAGLN2的相對(duì)熒光強(qiáng)度，分別是對(duì)照組轉(zhuǎn)染了 mimics-miR-1 control的42%和31%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示LASP1和TAGLN2是miR-1的下游調(diào)控靶分子，miR-1與LASP1和TAGLN2的3’-UTR結(jié)合后對(duì)它們進(jìn)行負(fù)性調(diào)控。
　　2在食管鱗癌細(xì)胞株Eca109中過表達(dá)miR-1對(duì)LASP1和TAGLN2蛋白表達(dá)的影響
　　Wes

22、tern blot檢測(cè)miR-1轉(zhuǎn)染48 h后，實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組靶基因LASP1和 TAGLN2蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示， mimics-miR-1組的 LASP1和TAGLN2蛋白表達(dá)水平低于其對(duì)應(yīng) mimics-miR-1 control組，而inhibitor-miR-1組的 LASP1和 TAGLN2蛋白表達(dá)水平高于其對(duì)應(yīng)inhibitor-miR-1 control組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　

23、1 miR-1可以通過與LASP1和TAGLN2的mRNA3’-UTR區(qū)結(jié)合抑制其表達(dá)，證明LASP1和TAGLN2是miR-1的靶基因。
　　2在食管鱗癌患者中miR-1可能是通過LASP1和TAGLN2途徑調(diào)控食管鱗癌的發(fā)展。
　　第四部分血漿miR-1作為食管鱗癌腫瘤標(biāo)志物的潛在診斷價(jià)值的研究
　　目的：研究食管鱗癌患者外周血中 miR-1的表達(dá)情況，探討其在食管鱗癌診斷中的應(yīng)用。
　　方法：采集23例初治

24、食管鱗癌患者及11例體檢健康人的血漿標(biāo)本，提取 RNA后采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（ quantitative real-time reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR）檢測(cè)血漿miR-1表達(dá)水平，分析其與食管鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系；同時(shí)比較其中10對(duì)術(shù)前和術(shù)后7~10 d食管鱗癌患者手術(shù)前后miR-1表達(dá)水平的變化；繪制受試者工作特征曲線并分析其診斷食管鱗

25、癌的價(jià)值。
　　結(jié)果：
　　1食管鱗癌患者和健康對(duì)照組血漿中miR-1的表達(dá)水平。
　　應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)食管鱗癌組與健康對(duì)照組血漿中 miR-1的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，食管鱗癌患者比對(duì)照組健康人血漿中miR-1的表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　2血漿miR-1在食管鱗癌患者手術(shù)前后表達(dá)變化。
　　食管鱗癌患者術(shù)后7-10 d外周血中miR-1的表達(dá)水平較術(shù)前顯著升高，差異具

26、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　3血漿miR-1表達(dá)與食管鱗癌患者臨床病理特征間的關(guān)系。
　　血漿miR-1的相對(duì)表達(dá)水平與食管鱗癌患者年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤大小均無明顯相關(guān)性（ P＞0.05）；但與淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P=0.005）；與組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，但統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異（P=0.083）。
　　4血漿miR-1在食管鱗癌診斷中的價(jià)值。
　　以23例食管鱗癌患者及11例健康對(duì)照者血漿miR-1的相對(duì)

27、表達(dá)量繪制ROC曲線，分析顯示，通過檢測(cè)血漿miR-1水平來區(qū)分健康人和食管鱗癌患者的曲線下面積是0.881[95%的置信區(qū)間（ confidence interval,95%CI）：0.743-1］，臨界值取0.688時(shí)，其特異度87%，靈敏度81.8%（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1血漿 miR-1在食管鱗癌患者中的表達(dá)明顯下調(diào)，且食管鱗癌術(shù)后miR-1表達(dá)上調(diào)。
　　2血漿miR-1有望成為用于食管鱗癌篩查