蘚化飲對DMBA誘導(dǎo)的金黃地鼠頰黏膜癌前病變逆轉(zhuǎn)作用的實驗研究.pdf

1、目的:口腔黏膜癌前病變是一種癌前狀態(tài),表現(xiàn)為口腔黏膜上皮細胞出現(xiàn)不同程度的不典型增生,但尚未發(fā)展成癌。新的WHO分類中指出癌前病變的最新定義為:“轉(zhuǎn)變?yōu)轺[狀細胞癌的可能性增加的發(fā)生改變的上皮。這種改變的上皮出現(xiàn)各種傳統(tǒng)上稱為上皮異常增生的細胞學(xué)和組織結(jié)構(gòu)的變化”。目前公認的癌前病變和癌前狀態(tài)包括白斑、紅斑、扁平苔蘚和口腔黏膜下纖維性變等。癌前病變?nèi)绻荒芗皶r治療而任其發(fā)展,最終會發(fā)展成癌,嚴重影響治療效果和預(yù)后,也給患者的生理及心理造成

2、巨大影響。如何對口腔黏膜癌前病變進行治療,阻斷其向口腔癌發(fā)展,已經(jīng)成為當前研究的熱點。目前針對口腔黏膜癌前病變的治療方法較多,主要有西藥口服、全身及局部應(yīng)用激素和免疫抑制劑、早期手術(shù)切除及中藥治療等。但應(yīng)用西藥療效不穩(wěn)定,激素及免疫抑制劑初期起效雖快但作用不持久且副作用大,而以往的中藥治療多結(jié)合局部激素應(yīng)用,單純應(yīng)用中藥治療癌前病變的報道較少,缺乏足夠的實驗研究來證實中藥的治療效果。針對口腔黏膜癌前病變的特點,中醫(yī)中藥在治療口腔黏膜癌前

3、病變方面具有明顯的優(yōu)勢:中藥標本同治、療效穩(wěn)固;口服湯劑或中成藥制劑,服用方法簡便,患者的依從性好,易于接受;與西藥相比副作用小等。鑒于以上的優(yōu)勢,中藥在治療癌前病變方面越來越受到人們的重視。本實驗采用中藥蘚化飲對實驗動物口腔黏膜癌前病變進行治療干預(yù),并通過流式細胞術(shù)和免疫組化方法觀察治療前后P53和COX-2表達情況,分析和探討蘚化飲對口腔黏膜癌前病變的逆轉(zhuǎn)作用。為今后臨床應(yīng)用提供實驗理論依據(jù)。
　　 方法:
　　 1

4、.口腔黏膜癌前病變動物模型制備及分組
　　 取敘利亞金黃地鼠(SPF級)55只,6～8周齡,體長約10cm,體重90～110g,雌雄兼?zhèn)?由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,生產(chǎn)許可證編號:SCXK(京)2007-0001。按照完全隨機化原則分為四組:空白對照組5只,癌前病變對照組10只,生理鹽水治療對照組10只,蘚化飲治療組30只。
　　 空白對照組每日正常飼養(yǎng),不做處理,直至實驗結(jié)束,與其余組一同處死并取材。

5、r>　　 癌前病變對照組、生理鹽水治療對照組、蘚化飲治療組均以0.5％DMBA涂抹雙側(cè)頰黏膜,每周三次,持續(xù)六周。
　　 2.中藥蘚化飲煎劑的制備
　　 先向組方中藥中加入約8～10倍的水,浸泡40分鐘～1小時,用武火加熱20～30分鐘至煮沸,保持約10分鐘,再以文火煎約10分鐘后,過濾,取汁;再加入相當于剩余濾渣量6倍的水,用武火加熱20～30分鐘至煮沸,用文火煎約10分鐘,加入砂仁,再煎約6～8分鐘,過濾,棄去濾渣

6、。合并兩次藥液,濃縮直到需要的藥液量(含生藥1g/m1),分裝,消毒,4℃儲存?zhèn)溆谩?br>　　 3.治療方法
　　 生理鹽水治療對照組、蘚化飲治療組分別以生理鹽水和中藥蘚化飲湯劑灌胃治療,1.6ml/只,每天一次,持續(xù)八周,處死全部動物并取材,固定,鏡檢。
　　 4.免疫組化法檢測P53及COX-2在各組中的表達
　　 取各組蠟塊,常規(guī)石蠟切片,脫蠟至水,按照S-P試劑盒操作說明進行操作,鏡下觀察空白對照組,

7、癌前病變對照組,生理鹽水治療對照組及蘚化飲治療組中的P53和COX-2的表達情況,并分析對比各組之間的表達情況是否存在差別,以評價中藥蘚化飲對口腔黏膜癌前病變的逆轉(zhuǎn)作用。
　　 5.流式細胞術(shù)
　　 石蠟包埋組織在切片機上連續(xù)切取40-50μm厚的組織片5-8片,放入試管中;二甲苯脫蠟,梯度酒精水化;生理鹽水沖洗,120目銅網(wǎng)輕搓組織,收集單細胞懸液;500目尼龍網(wǎng)過濾,離心,1000rpm,5分鐘;加入一抗工作液,室溫

8、下靜置40分鐘;加入二抗工作液,室溫下靜置1小時;機檢,讀取結(jié)果。
　　 6.統(tǒng)計學(xué)方法
　　 所有采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件,等級資料應(yīng)用秩和檢驗方法分析,計量資料以均數(shù)士標準差((X)±S)表示,應(yīng)用單因素方差分析對P53及COX-2檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析,α=0.05,P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.在癌前病變對照組、生理鹽水治療對照組及蘚化飲治療組50例標本中,隨機抽取10

9、例標本在光鏡下觀察,均發(fā)現(xiàn)上皮分層不規(guī)則,基底細胞極性喪失,滴狀釘突,細胞核多形性,核質(zhì)比例增加,細胞核增大,不典型分裂像,核仁增大、數(shù)量增加及核深染等不典型增生表現(xiàn),可說明癌前病變模型制備成功。
　　 2.免疫組化
　　 2.1 P53在空白對照組中陰性表達;在癌前病變對照組及生理鹽水治療對照組中均為強陽性表達;在蘚化飲治療組中為弱陽性表達。各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義,癌前病變對照組和生理鹽水治療對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

10、
　　 2.2 COX-2在空白對照組中陰性表達;在癌前病變對照組及生理鹽水治療對照組中均為強陽性表達;在蘚化飲治療組中為弱陽性表達。各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義,癌前病變對照組和生理鹽水治療對照組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.流式細胞術(shù)
　　 3.1 P53在各組中均有表達,空白對照組和蘚化飲治療組均為弱陽性表達,組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;癌前病變對照組及生理鹽水治療對照組中均為強陽性表達,組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;蘚化飲

11、治療組與癌前病變對照組相比,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.2 COX-2在各組中均有表達,空白對照組和蘚化飲治療組均為弱陽性表達,組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;癌前病變對照組及生理鹽水治療對照組中均為強陽性表達,組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;蘚化飲治療組與癌前病變對照組相比,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 4.相關(guān)性研究表明:P53與COX-2在口腔癌前病變的發(fā)生發(fā)展過程中,存在明顯正相關(guān)性。
　　 結(jié)論:
　　 1.