膽紅素致L-02細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡影響的研究.pdf

1、目的:探討不同劑量膽紅素致正常人肝細(xì)胞 L-02生長(zhǎng)及凋亡的變化。
　　方法:將不同濃度的膽紅素(0 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250mg/L、300 mg/L)作用于體外養(yǎng)的正常人肝細(xì)胞L-02,用倒置顯微鏡觀察其形態(tài)變化;采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法觀察不同濃度膽紅素作用L-02細(xì)胞24h后的相對(duì)存活率的影響;不同濃度膽紅素作用24h后,采用DNA瓊脂糖凝膠電泳;不同濃度膽紅素作用12h

2、后流式細(xì)胞儀Annexin-V和PI雙標(biāo)等技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;將 L-02接種于6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片后,用同濃度膽紅素作用24h,多聚賴氨酸處理玻片做免疫組化染色檢測(cè)Bcl-2與Bax蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:在倒置相差顯微鏡下對(duì)正常人肝細(xì)胞 L-02進(jìn)行觀察,對(duì)照組細(xì)胞24h形態(tài)無(wú)明顯變化呈上皮型貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞呈梭形或多邊形,低濃度(100 mg/L、150 mg/L)膽紅素作用的細(xì)胞12h內(nèi)細(xì)胞細(xì)胞貼壁良好,可見(jiàn)黃染;高濃度(2

3、00 mg/L、250mg/L、300 mg/L)膽紅素作用的細(xì)胞2h內(nèi)形態(tài)無(wú)明顯改變,4h后可見(jiàn)細(xì)胞被黃染,較多細(xì)胞突起、變圓,但細(xì)胞輪廓清晰,貼壁良好;6h可見(jiàn)細(xì)胞輪廓不清,少數(shù)細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)基中;12h可見(jiàn)較多細(xì)胞漂浮,并已開(kāi)始崩解。MTT法顯示膽紅素作用后L-02細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制,各組的OD值分別是0.2251±0.0324、0.2745±0.0466、0.6412±0.0734、0.7295±0.0337、0.7629±0.

4、0327、0.8322±0.0336。各濃度和對(duì)照組間、各濃度組見(jiàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=74.4644,p<0.05),除對(duì)照組與100mg/L組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(q=2.464,p>0.05),其余各時(shí)間組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。Hoechst33258熒光染色在各實(shí)驗(yàn)組均可見(jiàn)細(xì)胞凋亡,其中高濃度(200、250、300 mg/L)膽紅素組更為明顯,大量L-02細(xì)胞呈致密濃染,或呈碎塊狀致密濃染。低濃度(100、

5、150 mg/L)膽紅素組和對(duì)照組也可見(jiàn)少量細(xì)胞凋亡。對(duì)照組細(xì)胞瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn),DNA雙鏈完整,相對(duì)分子質(zhì)量大,滯留在加樣孔附近,未形成DNA條帶。膽紅素溶液高濃度組(200 mg/L、250mg/L、300 mg/L)出現(xiàn)典型的云梯狀細(xì)胞凋亡的DNA ladder,隨濃度增加圖像更清晰、典型。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,從0mmol/L劑量組到300mmol/L劑量組,凋亡率從1.24％上升到57.3%,各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<

6、0.05)。Bcl-2在300mg/L組偶見(jiàn)棕黃色顆粒狀,呈散在、弱陽(yáng)性表達(dá),200mg/L組與300mg/L組相比較陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多,染色加深,呈黃褐色表達(dá)。Bax主要在肝細(xì)胞胞漿呈棕黃色顆粒狀;對(duì)照組未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá),200mg/L組可見(jiàn)肝細(xì)胞散在、弱陽(yáng)性表達(dá),較150mg/L組有所增強(qiáng),陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多,250mg/L組陽(yáng)性染色進(jìn)一步加深,陽(yáng)性細(xì)胞多,300mg/L組肝細(xì)胞彌漫陽(yáng)性染色,染色加深,陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多。
　　結(jié)論:膽紅素可