銅誘導(dǎo)人肝細(xì)胞L-02的損傷作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究銅誘導(dǎo)人肝細(xì)胞L-02的損傷作用及其可能的作用機(jī)制,為預(yù)防和治療銅過(guò)載引起的疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　方法:以不同濃度的硫酸銅(0、50、100、150、200μmol/L)與L-02細(xì)胞共培養(yǎng)18小時(shí)作量效分析;以150μmol/L硫酸銅與L-02細(xì)胞共培養(yǎng)(0、6、12、18、24小時(shí))作時(shí)效分析。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力和線粒體整體功能。黃嘌呤氧化酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中超氧化物歧化酶(SOD)活性。比色法測(cè)定

2、還原型谷胱甘肽(GSH)含量。硫代巴比妥酸法(TBA)檢測(cè)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量。透射電鏡觀察線粒體超微結(jié)構(gòu)的變化。羅丹明123(Rh123)和碘化丙啶(PI)結(jié)合流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)線粒體膜電位(MMP)的變化和細(xì)胞凋亡率。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)細(xì)胞色素C(Cyt C)的釋放。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(x±S)表示,結(jié)果用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:
　　1. MTT結(jié)果顯示:銅呈劑量依賴性和時(shí)間依

3、賴性的抑制細(xì)胞生長(zhǎng)活力和破壞線粒體整體功能(p<0.05,p<0.01)。
　　2.實(shí)驗(yàn)觀察了銅對(duì)L-02細(xì)胞SOD活力和GSH、MDA含量的影響,發(fā)現(xiàn)銅能抑制細(xì)胞培養(yǎng)上清液中抗氧化酶SOD活性,降低 GSH含量,使氧化產(chǎn)物MDA生成增加(p<0.05,p<0.01)。
　　3.透射電鏡下觀察到線粒體結(jié)構(gòu)受到不同程度的損傷,并隨劑量增大和時(shí)間延長(zhǎng)損傷加重。線粒體腫脹明顯,輪廓不清楚;膜模糊不清,部分膜破裂;線粒體嵴明顯疏松溶

4、解,內(nèi)膜嵴不清甚至消失,大量空泡形成。
　　4.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)結(jié)果表明:隨著銅劑量增大,實(shí)驗(yàn)組 Rh123平均熒光強(qiáng)度逐漸降低,由對(duì)照組93.60±18.12下降至200μmol/L組59.94±13.55,即膜電位呈逐漸降低趨勢(shì);而細(xì)胞凋亡率逐漸增加,由對(duì)照組2.73％增加至200μmol/L組17.07%(p<0.05,p<0.01)。隨著銅作用時(shí)間的延長(zhǎng),Rh123平均熒光強(qiáng)度逐漸降低,由對(duì)照組93.60±18.12降

5、低至24h組55.74±15.45,即膜電位呈逐漸降低趨勢(shì);而細(xì)胞凋亡率逐漸增加,由對(duì)照組2.73%降低至24h組20.45%(p<0.05, p<0.01)。
　　5.免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Cyt C從線粒體釋放入胞漿,釋放量呈一定的劑量依賴性和時(shí)間依賴性。
　　結(jié)論:1.一定劑量范圍內(nèi),銅可誘導(dǎo)人肝細(xì)胞L-02損傷;
　　2.銅誘導(dǎo)人肝細(xì)胞L-02損傷的作用機(jī)制可能涉及氧化應(yīng)激損傷,致使線粒體膜電位(MMP)下