Rac1對(duì)L02肝細(xì)胞株上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化及增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的：
　　近年來(lái)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)在肝纖維化過(guò)程中的重要作用己逐漸被證實(shí)。眾多研究顯示Rac1在多種細(xì)胞內(nèi)具有調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重組，導(dǎo)致細(xì)胞板狀偽足形成和膜褶皺狀運(yùn)動(dòng)，促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和遷移，抑制細(xì)胞凋亡等作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）在誘導(dǎo)肝細(xì)胞EMT中也起到關(guān)鍵的作用。但是，Rac1

2、對(duì)肝上皮細(xì)胞中TGF-β1誘導(dǎo)的EMT的作用尚不清楚。本文將研究Rac1在TGF-β1誘導(dǎo)的LO2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用，及其對(duì)細(xì)胞增殖和凋亡的影響，以進(jìn)一步探討Rac1在肝纖維化發(fā)生和發(fā)展中的作用。
　　方法：
　　1、采用脂質(zhì)體法將含有Rac1基因的四組質(zhì)粒pExRed-NLS Flag（空載體組）、pExRed-NLS Flag Rac1（野生型Rac1組）、pExRed-NLS Flag Rac1T17N（顯性負(fù)調(diào)

3、控Rac1組）、pExRed-NLS Flag Rac1G12V（持續(xù)活化型Rac1組）分別轉(zhuǎn)染入肝上皮細(xì)胞LO2中并用5 ng/ml TGF-β1處理48 h。
　　2、免疫印跡法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后融合蛋白Flag-Rac1的表達(dá)。
　　3、采用免疫熒光法檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后上皮標(biāo)志物CK8和間質(zhì)標(biāo)志物vimentin的表達(dá)情況。
　　4、采用免疫印跡法觀察轉(zhuǎn)染48h后上皮標(biāo)志物CK8和間質(zhì)標(biāo)志物vimentin的表達(dá)情況。

4、r>　　5、采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室檢測(cè)轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的遷移能力。
　　6、采用CCK-8法測(cè)定不同濃度NSC23766處理的LO2細(xì)胞的增殖情況。
　　7、采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測(cè)不同濃度NSC23766處理后的LO2細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)果：
　　四組質(zhì)粒均瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到LO2細(xì)胞中。同空載體組和野生型Rac1組相比，持續(xù)活化型Rac1組的vimentin蛋白表達(dá)水平顯著增高，

5、CK8蛋白表達(dá)水平顯著降低;而同空載體組和野生型Rac1組相比，顯性負(fù)調(diào)控Rac1組vimen血蛋白表達(dá)水平降低，CK8蛋白表達(dá)水平顯著增高(P＜0.05)。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell法顯示同空載體組和野生型Rac1組相比，持續(xù)激活型Rac1組細(xì)胞遷移能力增加，顯性負(fù)調(diào)控Rac1組細(xì)胞遷移能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。NSC23766處理LO2后，細(xì)胞增殖被抑制(P＜0.05)，而各處理組細(xì)胞凋亡無(wú)明顯差異(P＞0.