神經干細胞腦內示蹤研究.pdf

1、目的：利用超順磁氧化鐵粒子(SPIO)標記大鼠胚胎神經干細胞(NSCs)，將其移植到創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)大鼠腦內后，用MRI觀察到其在宿主腦內的遷徙和分布：在此基礎上，進一步用錳增強磁共振(ME-MRI)技術檢測移植NSCs在腦損傷區(qū)所發(fā)揮的功能作用，以實現(xiàn)活體水平示蹤移植NSCs在動物腦內的遷徙以及功能重建的研究。同時，利用磁共振波譜(H-MRS)技術對內源性神經干細胞進行檢測，從而在活體水平實現(xiàn)無創(chuàng)性示蹤內源性NSCs。
　

2、　方法：
　　1.分離、培養(yǎng)大鼠胚胎神經干細胞(NSCs)，對其Nestin表達進行鑒定，并將其分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞；用SPIO磁化標記NSCs，通過普魯士藍染色明確轉染成功率，并測定SPIO標記NSCs的活性。
　　2.根據(jù)Feeney氏法建立TBI大鼠模型，約1周后行SPIO標記的NSCs立體定向腦內移植，術后第1，7，14，21，30天以及3月分別行T2加權梯度回波(GRE)序列MRI掃描，以示蹤移

3、植NSCs在宿主腦內的遷徙和分布等。
　　3.正常大鼠行ME-MRI掃描，經靜脈輸注MnCl2.4H2O，用甘露醇開放一側大腦半球血腦屏障(BBB)，電刺激其對側前肢后，即行T1加權三維快速擾相位梯度回波(3D-FSPGR)序列掃描；而另一組正常大鼠在ME-MRI中行鈣通道阻滯劑實驗，即在電刺激階段經靜脈注射地爾硫卓。
　　4.接受SPIO標記NSCs移植的TBI大鼠在移植后2-4周左右，MRI可示蹤到移植NSCs遷徙到腦損

4、傷區(qū)，大鼠腦切片普魯士藍染色證實SPIO標記NSCs的存在，此時行ME-MRI掃描，實驗步驟同正常大鼠。末接受NSCs治療的TBI大鼠亦行SPIO-MRI和ME-MRI掃描作為對照組，并比較兩組大鼠的神經系統(tǒng)行為學表現(xiàn)的差別。
　　5.H-NMR測定神經干細胞、神經元和膠質細胞之間波峰差別，確定神經干細胞的特定波峰及其與神經發(fā)生區(qū)相關性，然后利用MRS檢測成年大鼠以及成人腦內皮層和海馬區(qū)神經干細胞的含量。
　　結果：

5、　　1.細胞熒光免疫染色示大鼠胚胎神經干細胞呈Nestin陽性并能定向分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞，SPIO轉染后行普魯士藍染色可見細胞胞質內的陽性藍色顆粒，MTT法證實標記細胞的存活率無降低。
　　2.根據(jù)Feeney氏法建立的TBI大鼠模型術后表現(xiàn)為對側肢體的活動障礙，1周后行NSCs移植治療，術后用MRI觀察其在腦內能向損傷病灶遷徙，表現(xiàn)為NSCs注射部位、腦損傷區(qū)周圍以及兩者之間的路線的低信號，并且腦損傷區(qū)及其

6、周圍腦切片普魯士藍染色可發(fā)現(xiàn)陽性藍色顆粒細胞，證實SPIO標記的NSCs能遷徙到損傷區(qū)并向病灶內彌散。
　　3.正常大鼠ME-MRI掃描顯示相應的體感運動皮層區(qū)和觸須皮層區(qū)存在高信號，表明局部有神經元電活動引起的錳離子聚集。而在電刺激過程中引入鈣通道阻滯劑地爾硫卓后，相應體感運動皮層區(qū)的高信號消失，而側腦室等區(qū)域仍表現(xiàn)為高信號，說明錳離子是伴隨著鈣通道的開放而進入興奮性神經細胞的，錳增強依賴性信號增加能夠被鈣通道阻斷劑拮抗。

7、>　　4.TBI大鼠接受經SPIO標記的NSCs移植治療后2-4周左右，用MRI可觀察到移植NSCs能從注射點遷徙到損傷病灶區(qū)，普魯士藍切片染色證實為SPIO標記的NSCs。此時行ME-MRI掃描可發(fā)現(xiàn)大鼠肢體功能損傷區(qū)局部有高信號，而未行NSCs移植的TBI大鼠在ME-MRI上并未發(fā)現(xiàn)這些高信號區(qū)，在應用鈣通道阻滯劑地爾硫卓后，這些高信號又消失。這些數(shù)據(jù)表明移植的NSCs不僅能遷徙到腦損傷區(qū)，而且能在病灶部位分化、形成有功能的突觸聯(lián)系

8、并參與局部大腦功能活動。與此相一致的是，經NSCs治療的TBI大鼠的神經系統(tǒng)行為學評分較未行NSCs移植的TBI大鼠有明顯的改善。
　　5.H-NMR體外測定神經干細胞存在1.28ppm特定波峰，并與神經發(fā)生相關；然后利用MRS分析成年大鼠以及成人腦內皮層和海馬區(qū)神經干細胞的含量，經SVD轉換檢測到成年大鼠和成人腦內海馬區(qū)存在少許神經干細胞，而皮層區(qū)檢測不到神經干細胞，這與成體腦內海馬區(qū)存在神經發(fā)生相一致。
　　結論：本實驗