干細胞示蹤技術進展

1、干細胞示蹤技術進展,吳海東,干細胞示蹤技術進展,大量動物和臨床研究均表明干細胞移植確實能改善心、腦和肝等器官功能，干細胞移植治療器官功能缺損性疾病如缺血性心臟病、心力衰竭 （心衰），腦血管疾病、腦損傷、肝硬化或肝功能衰竭，神經損傷等級已成為21世紀醫(yī)學的標志性成果。然而， 評價細胞植入、分布、存活、遷移、分化和功能的干細胞標記示蹤研究明顯滯后于整體功能改善的觀察，成為干細胞治療機制探討的瓶頸因素和新的研究熱點。,示蹤方法,體外示蹤（病理

2、學示蹤）體內示蹤：MR、核素顯像、光學成像,病理學示蹤,移植前體外預先標記培養(yǎng)的干細胞，包括熒光染料標記 （標記細胞核或細胞膜） 核素標記方法 Y染色體標記報告基因轉染,細胞核標記物,5-溴-2-脫氧尿嘧啶核苷 （BrdU） 標記DAPI標記Hoechst 染色,BrdU標記,BrdU是DNA 前體胸腺嘧啶核苷的同類物， 能與內源性胸腺嘧啶競爭性地參與1 期細胞單鏈DNA合成從而標記細胞核， 細胞核免疫熒光染色后利用熒光顯

3、微鏡或激光共聚焦顯微鏡發(fā)射一定波長紫外光激發(fā)后觀察， 亦可通過免疫組化染色識別BrdU鑒定移植細胞。,BrdU標記,BrdU標記,DAPI標記,DAPI熒光染料化學名稱為4’，6聯脒-2-苯基吲哚（4’‘6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride, DAPI）,能與富含A-T堿基對DNA專一結合從而標記細胞核， 紫外光激發(fā)下發(fā)出淺藍色熒光。,DAPI標記,優(yōu)點： （1） 熒光保持時間較長、 專

4、一性強、靈敏度高； （2） 標記技術簡單， 標記效率高。缺點：細胞分裂將導致DAPI標記強度降低、 靈敏度下降。僅適于短期定量分析。且標記的細胞死亡后可釋放出DAPI， 將周圍未標記的細胞標記從而產生假陽性。,,DAPI標記,Hoechst染色,Hoechst是能與DNA A-T堿基對特異性結合的雙苯并咪唑熒光染料， 細胞核著色， 紫外光激發(fā)下發(fā)出藍色熒光。 優(yōu)點：染色快（1~3h）， 標記率100%， 可標記成體干細胞， 常用

5、的有Ho33342和Ho33258。存在的問題主要是部分干細胞對該染料拒染。,Hoechst染色,細胞膜標記,Dil標記：是一種親脂性碳花青染料， 以類似于磷脂的方式與脂蛋白結合嵌進生物質膜內， 并在膜內做定向擴散運動從而標記整個細胞。其特點是特異性強， 靈敏度高。CM-Dil作為膜標記物存在把標記物轉移到未標記細胞的現象，10umol/L標記濃度10d 是安全的， 之后就開始轉移到非標記細胞；40umol/L濃度1 周就開始轉移，

6、 而且活細胞之間、 活細胞與死細胞之間都有轉移現象。因此， CM-Dil比較適合短期的標記示蹤。,CM-Dil膜標記,PKH26、PKH67標記,PKH26、PKH67分別是紅色、 綠色的親脂性碳花青熒光染料，與細胞膜的脂質區(qū)域能穩(wěn)定結合，清晰地顯現細胞的結構。因熒光染料會隨著隨干細胞的增生和分化、時間的流失而稀釋淬滅，在一定時間將檢測不到標記的細胞，PKH26、PKH67被應用于體內外的短期細胞追蹤研究,PKH26標記,熒光染料標記

7、方法,優(yōu)點：化學性結合， 容易操作， 對細胞的增殖和分化基本沒有影響。缺點： 1. 隨著干細胞的增生和分化而稀釋， 隨時間的流失而淬滅， 以至于最終完全不能檢出， 因而不適合做長時期的體內標記追蹤。2.細胞在受體內是否存活難以證明， 因為標記細胞凋亡或死亡后可釋放標記物標記周圍細胞造成假陽性， 而且被巨噬細胞吞噬后， 細胞碎片在巨噬細胞內也可以有熒光表達。3. 此類熒光標記只能判斷細胞的存在， 無法觀察細胞形態(tài)。,核素標記—可用

8、于體內外示蹤,目前常用來示蹤標記的核素有3H-、125I-、14C-、99mTc、32P-等， 其中以氚標記脫氧胸腺嘧啶核苷 （3H-TDR） 應用最為廣泛， 主要用于檢測干細胞的細胞動力學和增殖研究。細胞增殖時需攝取各種嘧啶核苷，3H-TDR作為 DNA補救合成的前體， 可較特異地在 S期摻入細胞 DNA 中。干細胞分裂增殖快，3H-TDR 易被摻入標記。核素標記干細胞移植治療后在同一張切片上作放射自顯影+免疫組化也可觀察移植細胞在

9、體內的分布、 遷移情況。核素示蹤靈敏度高， 可以穩(wěn)定長期地示蹤。存在的問題是有一定的放射性污染， 檢測復雜。,,Y染色體標記,目前國際上比較認可的Y染色體標記細胞追蹤移植細胞技術是選用雄性供體和雌性宿主， 利用Y染色體作為標志物。優(yōu)點：標記技術簡單，且標記效率很高， 利用熒光原位雜交（FISH） 技術進行追蹤熒光標記的細胞能清楚地觀察到， 適合長期體內試驗定量分析。存在的問題是不能觀察自體細胞移植研究， 且追蹤異體移植細胞時需要雄

10、性供體， 雌性宿主， 有較大的局限性。,Y染色體,報告基因轉染,利用基因載體將標志基因導入干細胞中， 通過篩選獲得表達標志基因的細胞， 然后通過熒光顯微鏡可直接觀察移植細胞在體內的生物學情況， 此類標志基因主要有綠色熒光蛋白 （green fluorescent protein, GFP） 、B-半乳糖苷酶等，以GFP應用最廣泛。,報告基因轉染,綠色熒光蛋白,,聶君，李勁松，王建軍，等. 大鼠骨髓間充質干細胞的生物學特性和示蹤標記[J]

11、. 中華實驗外科雜志,2010,27(10):1432-1435.,攜帶EGFP基因慢病毒載體能高效感染MSCs,EGFP可作為MSCs體內研究的示蹤標記.,體內跟蹤，分子成像技術,MRICTNUCLEAR MEDICINE（PET）Ultrasonography (USG) OPTICAL IMAGING,分子成像技術,自1999 年 Weissleder提出分子影像學概念以來， MRI、核醫(yī)學成像和光學成像蓬勃發(fā)展， 因還未

12、研發(fā)針對干細胞特異性或相對特異性標志分子的示蹤劑， 核醫(yī)學成像應用較少。目前在干細胞示蹤研究中應用較多的主要是磁標記細胞MRI示蹤成像和光學成像， 但光學成像尚處于僅應用于小動物實驗性成像階段。,,核磁共振成像原理,原子核帶有正電，許多元素的原子核，如1H、19FT和31P等進行自旋運動。通常情況下，原子核自旋軸的排列是無規(guī)律的，但將其置于外加磁場中時，核自旋空間取向從無序向有序過渡。自旋系統(tǒng)的磁化矢量由零逐漸增長，當系統(tǒng)達到平衡時，

13、磁化強度達到穩(wěn)定值。如果此時核自旋系統(tǒng)受到外界作用，如一定頻率的射頻激發(fā)原子核即可引起共振效應。在射頻脈沖停止后，自旋系統(tǒng)已激化的原子核，不能維持這種狀態(tài)，將回復到磁場中原來的排列狀態(tài)，同時釋放出微弱的能量，成為射電信號，把這許多信號檢出，并使之能進行空間分辨，就得到運動中原子核分布圖像。原子核從激化的狀態(tài)回復到平衡排列狀態(tài)的過程叫弛豫過程。它所需的時間叫弛豫時間。弛豫時間有兩種即T1和T2，T1為自旋-點陣或縱向馳豫時間，T2為自旋-

14、自旋或橫向弛豫時間。,核磁共振成像原理,磁共振最常用的核是氫原子核質子（1H），因為它的信號最強，在人體組織內也廣泛存在。影響磁共振影像因素包括：(a)質子的密度；(b)弛豫時間長短；(c)血液和腦脊液的流動；(d)順磁性物質(e)蛋白質。磁共振影像灰階特點是，磁共振信號愈強，則亮度愈大，磁共振的信號弱，則亮度也小，從白色、灰色到黑色。各種組織磁共振影像灰階特點如下；脂肪組織，松質骨呈白色；腦脊髓、骨髓呈白灰色；內臟、肌肉呈灰白色；液體

15、，正常速度血液呈黑色；骨皮質、氣體、含氣肺呈黑色?！　『舜殴舱竦牧硪惶攸c是流動液體不產生信號稱為流動效應或流動空白效應。因此血管是灰白色管狀結構，而血液為無信號的黑色。這樣使血管很容易軟組織分開。正常脊髓周圍有腦脊液包圍，腦脊液為黑色的，并有白色的硬膜為脂肪所襯托，使脊髓顯示為白色的強信號結構。核磁共振已應用于全身各系統(tǒng)的成像診斷。效果最佳的是顱腦，及其脊髓、心臟大血管、關節(jié)骨骼、軟組織及盆腔等。對心血管疾病不但可以觀察各腔室、大血管

16、及瓣膜的解剖變化，而且可作心室分析，進行定性及半定量的診斷，可作多個切面圖，空間分辨率高，顯示心臟及病變全貌，及其與周圍結構的關系，優(yōu)于其他X線成像、二維超聲、核素及CT檢查。在對腦脊髓病變診斷時，可作冠狀、矢狀及橫斷面像。,MRI活體示蹤磁標記細胞,MRI活體示蹤移植干細胞前提是需用MR對比劑磁化標記細胞， 以使能與宿主細胞相區(qū)分。MR對比劑1.主要產生T1正性對比效應的Gd3+，檢測閥值過高，實用價值不大。2. T2 負性對比

17、效應，但對 T1 弛豫的加快作用較弱：通過葡聚糖生物高分子包裹 Fe3O4 晶體形成核殼式結構的超順磁性氧化鐵 （Superparamagnetic iron oxide，SPIO）納米材料(Feridex）。3. 氯化錳：有一定的細胞毒性。標記方法簡單，有獨特的成像功能。,釓-熒光雙標記及MRI體外示蹤,釓-熒光雙標記及MRI體外示蹤,沈君，周翠屏，成麗娜，等. 大鼠骨髓間充質干細胞的釓-熒光雙標記及MRI體外示蹤的研究[J]. 中

18、華放射學雜志,2008,42(4):426-431.,磁標記細胞MR成像原理,具有超順鐵磁性的Fe3O4晶體低濃度即能顯著地造成局部磁場的不均勻， 使鄰近氫質子在弛豫中很快產生相散， 加速了質子去相位過程， 縮短了組織的T2值， 在梯度回波和自旋回波序列MRI中， 使組織信號降低從而產生較強的T2 負性對比效應， 常規(guī)1.5T MR成像就能顯示被標記的干細胞， 但SPIO對 T1 弛豫的加快作用較弱。SPIO在體內可生物降解被細胞代謝

19、， 示蹤細胞至少可達 3個月， 假陽性低。因此，MRI示蹤磁標記細胞是活體內最理想的細胞示蹤方法。,磁共振示蹤突出的優(yōu)勢,極佳的空間分辨力,掃描能明確部位，實時顯像并連續(xù)跟蹤標記的細胞。能用于導向治療和跟蹤。檢測細胞閾值遠低于有效治療劑量。磁共振細胞示蹤時間不僅與細胞轉歸相關， 還與細胞內鐵含量、 局部注射細胞量、 磁共振儀器分辨力、 成像條件調節(jié)有關。,MRI示蹤存在的問題,尚無磁共振示蹤應用于人類臨床試驗的報道原因： （1

20、）安全性有待進一步研究： 雖然大部分研究表明順磁性鐵標記后不影響干細胞的活性、 增殖和向其他細胞的分化能力， 但也有作者報道標記后的骨髓間充質干細胞向軟骨細胞的分化能力受損。（2）靈敏度相對不足（3）非特異性顯像：標記干細胞在體內死亡、 裂解， 釋放出的氧化鐵顆粒能否造成非特異性顯像尚無定論。,不能長期示蹤,由于氧化鐵不能夠跟隨細胞的分裂而自體復制， 所以在監(jiān)測移植后干細胞的增殖和分化方面存在一定不足。,本科的研究結果,,,,朱文珍

21、，李祥，漆劍頻，等. 以超順磁性氧化鐵標記的神經干細胞移植后的磁共振成像示蹤研究[J]. 中華器官移植雜志,2007,28(5):299-302.,,Modo M, Mellodew K, Cash D, et al. Mapping transplanted stem cell migration after a stroke: a serial, in vivo magnetic resonance imaging study[J]

22、. NeuroImage,2004,21(1):311-317.,,黃浙勇，葛均波，楊姍，等. 超順磁性氧化鐵標記間充質干細胞心肌移植的磁共振成像研究[J]. 中華心血管病雜志,2007,35(4):344-349.,,黃浙勇，葛均波，楊姍，等. 超順磁性氧化鐵標記間充質干細胞心肌移植的磁共振成像研究[J]. 中華心血管病雜志,2007,35(4):344-349.,,MRI示蹤細胞的敏感性不夠理想，心肌內局部注射的顯像閥值為1*105

23、。局部移植遷移量有限，如何才能敏感的反映出少量細胞的活動？ 黃浙勇，葛均波，楊姍，等. 超順磁性氧化鐵標記間充質干細胞心肌移植的磁共振成像研究[J]. 中華心血管病雜志,2007,35(4):344-349.,fluorescent-magnetite-nanocluster(FMNC),增強敏感性的方法—納米材料包裹法,,增強敏感性的方法—納米材料包裹法,FMNC,,,跟蹤時間短,細胞自健側向受損區(qū)遷移,檸檬酸鹽包裹的SP

24、ION,錳離子增強磁共振成像,Mn2+作為強順磁性鈣離子競爭劑,可以通過鈣離子通道進入神經細胞,并可通過軸突、突觸運輸,減少含Mn2+組織的T1值,從而增強區(qū)域T1加權MRI信號.目前,MEMRI主要用于三方面的研究:活動誘導觀察腦的功能活動,在體、動態(tài)地追蹤神經傳導通路,并可以精細觀察腦部形態(tài)學.MEMRI在多領域的研究結果表明它是探測生物體內的分子過程和大腦功能活動的重要工具和手段.錳亦可作為干細胞體內移植的示蹤劑，但目前研究

25、較少，而且錳有一定的毒性，合適的濃度和劑量須待進一步研究。,放射性核素顯像示蹤,放射性核素顯像示蹤在心臟細胞移植中的應用： 核素標記的優(yōu)點是背景信號低， 信噪比較高， 能檢測經血管注射后向缺血心肌歸巢的少量干細胞。用于標記心臟治療細胞的核素有111銦（111In）、锝依莎美肟 （99mTc-HMPAO）、 18氟-脫氧葡萄糖 （18F-FDG）等。單光子發(fā)射計算體層攝影（SPECT）可示蹤細胞一直到注射后 3 天， 但臨床磁共振機未能

26、對 Feridex標記干細胞顯像。說明靜脈注射后真正分布到心臟的標記細胞數量有限， 磁共振成像敏感性不如核素顯像。,目前存在的問題,核素標記也可能對治療細胞有放射性損害， 甚至有癌變的潛在危險。損害的大小與放射性元素的物理學特性和特定細胞的易感性有關。核素半衰期短（18F-FDG 110 min）， 損害小， 但成像觀察時間也相應縮短。111In半衰期較長 （67 h） 加上β射線短， 已有報道損害造血干細胞的增殖分化， 但對內皮祖

27、細胞似乎沒影響。,放射性核素顯像示蹤,和磁共振示蹤相反， 放射性核素顯像靈敏度較高， 能檢測標記細胞的生物學分布， 包括外周血管注射后歸巢到心肌的細胞百分比， 但觀察時間受核素衰減的制約， 且空間分辨力低。存在非特異性顯像： 成像信號與細胞存活并不直接相關， 各種原因引起的核素標記物從細胞釋放將導致非特異性信號的產生， 甚至在細胞死亡后仍有可能觀察到成像信號。其次， 細胞分裂對影像學的影響也尚未明了。,報告基因顯像,原理：在體外用各種

28、載體技術將報告基因轉移入待移植細胞， 檢測報告基因的表達率后注入體內，通過靜脈注射特異性核素標記的報告探針便可檢測出表達報告基因的移植細胞。優(yōu)點：由于報告探針的積聚依賴于報告基因的表達以及表達產物的活性， 因此信號強度與治療細胞的活性相關， 這種特異性檢測能力是直接標記不可比擬的。況且， 檢測不受時間的限制， 可反復進行， 而直接標記存在核素衰減、 鐵制劑釋放導致示蹤周期短的缺陷。,報告基因最大的挑戰(zhàn),是如何保證影像信號的強度和穩(wěn)定

29、性。與直接標記不同， 報告基因顯像需要注射報告探針，報告探針在靶細胞的積聚有賴于體內的生物學過程。與直接心肌基因轉導相比， 靶位置中少量存活植入細胞的報告基因表達量極少， 需要增加報告探針的劑量， 而這勢必增加非特異性背景信號。光學顯像雖能敏感檢測少量細胞， 但不能斷層成像， 不能應用于大動物或人類。另外， 核素報告基因顯像需要較大量的細胞。,理想的活體細胞示蹤劑,（1）安全性： 不影響細胞存活、 生長、 分化及其他生物學作用；

30、不影響細胞基因組成； 有其清除途徑； 如從攜帶細胞釋放， 不影響周圍組織和受者。（2）靈敏度： 能準確反映少量標記細胞的行為 （包括位置、 移行） 和標記細胞的數量等。（3）特異性： 能反映標記細胞外移、 死亡或被巨噬細胞吞噬等情況， 間質對標記細胞或標記物的非特異性處置不應對靶細胞數量和生物學活動造成錯誤判斷。,理想的活體細胞示蹤劑,（4）長久性： 示蹤時間較長， 標記物不會自動衰減或隨細胞分裂而稀釋， 可用非侵入性方法反復探測示