嗅鞘細(xì)胞聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞腦內(nèi)移植治療帕金森病的實驗研究.pdf

1、目的：探討嗅鞘細(xì)胞(OECs)聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)腦內(nèi)移植對NSCs增殖、分化及對PD大鼠的治療作用。 方法：l、NSCs培養(yǎng)：取E14.5 dSD大鼠腹側(cè)中腦組織制備成單細(xì)胞懸液，接種到含有表皮生長因子(Epidermal growth factor,EGF)，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast growth factor-basic,bFGF)B27(B27 suplement)的DMEM/F12(1：1)的

2、無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待形成原代克隆球后,用有限稀釋法進行單細(xì)胞克隆和傳代擴增，以獲得大量來源相同的NSCs克隆球，并進行Brdu和Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)檢測。2、OECs培養(yǎng)：取E14.5 d SD大鼠兩側(cè)嗅球組織制備成細(xì)胞懸液，離心后去上清，將細(xì)胞濃度調(diào)整到1×10<.6>個/ml，移至含20﹪胎牛血清OECs培養(yǎng)液培養(yǎng)。3、將培養(yǎng)傳至第三代的OECs與NSCS共培養(yǎng)。用P<'75>免疫組化法，P<'75>/Nestin， P<'7

3、5>，Brdu/Nestin，GFAP，NF，NF/rH免疫熒光法分別鑒定OECs和NSCs的增殖與分化。4、立體定位下，于左側(cè)黑質(zhì)致密部(SNC)和腹側(cè)被蓋(VTA)注射6-OHDA制備PD大鼠模型。將成功PD大鼠模型隨機分成5組，即假手術(shù)對照組(注入生理鹽水)；NSCs移植組；OECs移植組；OECs+NSCs移植組和模型對照組。5、將上述培養(yǎng)傳代至第3代的NSCs、OECs和OECs+NSCs，濃度為1.0x106細(xì)胞/μl，分別

4、移植到PD大鼠吻側(cè)紋狀體內(nèi)，于移植后7d、14d、30d、60d檢測PD大鼠旋轉(zhuǎn)行為變化后，深麻下處死，灌流固定取腦做冰凍切片，行HE染色和Brdu，TH，P<'75>，Brdu/TH，Brdu/P<'75>免疫組化和免疫熒光染色。 結(jié)果：1、OECs在培養(yǎng)7 d時，絕大多數(shù)呈梭形且發(fā)出2至3個突起，少量呈扁平橢圓形，免疫組化呈P<'75>陽性反應(yīng)。2、NSCs培養(yǎng)7 d時，顯示典型的神經(jīng)球懸浮生長，呈Brdu/Nestin免疫

5、熒光雙標(biāo)陽性；10d后細(xì)胞活性下降，球體積不再增大，球中心透亮度明顯下降：14d后偶見神經(jīng)球貼壁分化，GFAP和NF免疫熒光檢測顯示，大部分為紅色熒光標(biāo)記的GFAP<,+>細(xì)胞，少數(shù)為綠色熒光標(biāo)記的NF<'+>細(xì)胞。3、OECs+NSCs共培養(yǎng)組在5d時形成神經(jīng)球；10d時球體積不斷增大，球中心透亮度良好；12d后神經(jīng)球的體積不再增大，開始貼附在OECs上生長，可見神經(jīng)球向四周伸出突起并開始分化：14d時緊貼OECs生長的NSCs，同O

6、ECs廣泛交織在一起，P<'75>/Nestin免疫熒光染色可見紅色熒光Nestin標(biāo)記的NSCs，綠色熒光P<'75>標(biāo)記的OECs; GFAP和NF免疫熒光染色顯示，大部分為綠色熒光標(biāo)記的NF<'+>細(xì)胞，小部分為紅色熒光標(biāo)記的GFAP<'+>細(xì)胞。OECs+NSCs共培養(yǎng)組和NSCs單獨培養(yǎng)組NF陽性細(xì)胞率分別為69.5﹪，47.2﹪，前者明顯高于后者(P<0.05)；其中向TH分化的比例，共培養(yǎng)組是36.7﹪，而NSCs單獨培養(yǎng)

7、組僅6.34﹪(P<0.05)。4、細(xì)胞移植后第1周，各組大鼠的旋轉(zhuǎn)行為無明顯變化；第30天和60天時，與假手術(shù)組和模型對照組比較，旋轉(zhuǎn)行為有較為明顯的改善(P<0.05)，其中OECs+NSCs共移植組的旋轉(zhuǎn)行為改善較單純移植NSCs組和單純移植OECs更為明顯(P<0.05)。5、HE染色顯示，移植后一天，移植細(xì)胞呈簇狀或串狀沿針道分布，細(xì)胞數(shù)量較多。6、Brdu免疫熒光染色顯示，移植區(qū)Brdu陽性細(xì)胞為FITCJ碌色熒光標(biāo)記，大多

8、數(shù)細(xì)胞較小，無突起，呈圓形或橢圓形，少數(shù)呈多邊形或不規(guī)則形態(tài)。隨著時間的推移，Brdu陽性細(xì)胞數(shù)量越來越少。7、TH免疫熒光顯示，從第7天起，在移植區(qū)可見胞漿呈羅丹明紅色熒光標(biāo)記的TH陽性神經(jīng)元(15-27個/視野)，呈圓形或橢圓形，無明顯突起，分布在針道與紋狀體實質(zhì)的交界處；在第30天，在針道的兩側(cè)TH陽性神經(jīng)元增多(28-34個/視野)，有的可見少許突起。NSCs移植組和OECs移植組在移植區(qū)也可見少數(shù)羅丹明紅色熒光標(biāo)記的TH陽性神

9、經(jīng)元。經(jīng)過圖像處理和數(shù)據(jù)統(tǒng)計，OECs+NSCs移植組TH神經(jīng)元陽性率高于NSCs、OECs單獨移植組(P<0.05)。 結(jié)論：1、從E14.5胚胎大鼠腹側(cè)中腦組織可以分離得到具有不斷增殖和自我更新能力的NSCs。2、在體外培養(yǎng)條件下，OECs有促進NSCs增殖和誘導(dǎo)其分化的作用，其中分化成神經(jīng)元的比例高于星形膠質(zhì)細(xì)胞，并有部分可以分化為TH陽性神經(jīng)元。3、NSCs、OECs分別單獨移植或OECs+NSCs聯(lián)合移植APD大鼠的紋