TNF-α受體ⅠCRD4區(qū)衍生小肽Pep3對TNF-α誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、心肌肥大是心臟對多種病理刺激產(chǎn)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)，心肌肥大最終走向心衰，引起病人死亡。其病理變化表現(xiàn)為胚胎基因如心鈉肽、腦鈉肽和β-肌球蛋白重鏈等表達(dá)增加、蛋白合成增加、心肌細(xì)胞體積增大、肌原纖維重構(gòu)等。
　　 腫瘤壞死因子是一具有多種效應(yīng)的炎癥性細(xì)胞因子，晚期心衰患者血清中TNF-α水平升高，在各種心肌功能損傷(如心衰有關(guān)的炎性與肥大等)的情況下都會(huì)過量表達(dá)，由心肌細(xì)胞和存在于心臟的巨噬細(xì)胞分泌，參與許多心肌病變的發(fā)生過程。T

2、NF-α是一種重要的促心肌細(xì)胞肥大因子，它引起心肌細(xì)胞肥大的機(jī)制目前尚不清楚。
　　 針對TNF-α的抗心衰治療措施是心衰治療領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。大分子蛋白類TNF-α抑制劑具有特異性好、結(jié)合能力強(qiáng)的特點(diǎn)，但也存在著穩(wěn)定性較差，在患者體內(nèi)易降解并極易產(chǎn)生免疫耐受、不良反應(yīng)明顯等特點(diǎn)。因此，探索新的免疫抑制劑研究策略來研制靶向抗TNF-α的小分子藥物或針對受體特定區(qū)域的小分子多肽，已成為當(dāng)前TNF-α抑制劑研發(fā)的熱點(diǎn)。針對此靶點(diǎn)的

3、化學(xué)小分子類藥物盡管理論上講應(yīng)當(dāng)是最理想的藥物，但目前以靶蛋白及其受體的復(fù)合晶體結(jié)構(gòu)為模板進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)及虛擬篩選并沒有研發(fā)出理想的抗TNF-α的抑制劑。短肽抑制劑，由于分子量較小、作用區(qū)域明確，被認(rèn)為是一類較為理想的新型TNF-α受體拮抗劑。以這些肽為前導(dǎo)物，依據(jù)它們的功能基團(tuán)的組成及功能基團(tuán)的空間構(gòu)象，合成與它們具有相同構(gòu)象的非肽小分子模擬物，可以在新型抗心衰藥物的開發(fā)中起導(dǎo)向作用。
　　 在心肌肥大發(fā)生發(fā)展過程中，

4、細(xì)胞內(nèi)鈣信號傳遞途徑是誘導(dǎo)心肌肥大的最重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。胞內(nèi)Ca2+增加是致心肌肥大的最基本信號，胞內(nèi)Ca2+增加激活鈣/鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶，激活下游信號通路，活化多種心肌肥大的相關(guān)基因，從而引起心肌肥大。其中，鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號通路在胞內(nèi)Ca2+升高誘導(dǎo)的心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵性的作用。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高可以激活CaN，繼而使胞質(zhì)中活化T細(xì)胞核因子去磷酸化，去磷酸化的NFATc4通過暴露其上的核定位信號，轉(zhuǎn)位入細(xì)胞核

5、，再與心肌細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子如鋅指轉(zhuǎn)錄因子(GATA4)相互作用，活化多種心肌肥大的相關(guān)基因，調(diào)節(jié)心臟中ANF、BNP等肥大基因特異性表達(dá)，導(dǎo)致心肌肥大。
　　 研究表明，TNF-α能通過干擾心肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度([Ca2+]i)，降低鈣瞬變從而抑制心肌細(xì)胞收縮，但TNF-α對心肌細(xì)胞[Ca2+]i的影響尚不明確。
　　 Pep 3(LRENECVS)是本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)Ⅰ型TNF-α受體(TNF-R1)細(xì)胞外區(qū)域亞功能域CR

6、D4區(qū)域設(shè)計(jì)，從多個(gè)序列中篩選出的一條優(yōu)選小肽(Pep 3序列已申請國家專利保護(hù)，申請?zhí)枺?00810218732.2)，是一種多肽類TNF-α受體拮抗劑，前期研究表明其能夠顯著抑制TNF-α和TNF-R1的結(jié)合。本文設(shè)想TNF-α能夠通過Ca2+-CaN-NFATc4信號通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，而Pep 3能抑制TNF-α的這種作用，從而為開發(fā)新型抗心衰藥物提供理論導(dǎo)向。
　　 本課題分兩部分進(jìn)行。
　　 第一部分建立T

7、NF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞肥大模型，確定刺激的濃度和時(shí)間。
　　 第二部分采用上述細(xì)胞模型觀察Pep 3是否有抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。
　　 第一節(jié)、TNF-α誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大模型的建立研究目的建立TNF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞肥大模型。
　　 研究方法：
　　 1.采用本室建立的改良法培養(yǎng)SD乳鼠心肌細(xì)胞。
　　 2.采用熒光定量PCR檢測

8、肥大基因ANF和BNP mRNA表達(dá)水平。
　　 3.倒置相差顯微鏡觀察刺激后心肌細(xì)胞表面積的變化并統(tǒng)計(jì)分析。
　　 結(jié)果：細(xì)胞表面積測定結(jié)果顯示，TNF-α(10-50ng/ml)可以濃度依賴性地增加乳鼠心肌細(xì)胞表面積，其中25 ng/ml有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，vs空白對照組)。TNF-α(25 ng/ml)可以時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)心肌表面積增加，刺激24小時(shí)最為明顯(P＜0.05，vs空白對照組)。熒光定量PCR結(jié)

9、果顯示，TNF-α(25 ng/ml)可以時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)心肌細(xì)胞ANF和BNP mRNA表達(dá)水平升高，12小時(shí)和24小時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，vs空白對照組)，而48小時(shí)恢復(fù)至正常水平。
　　 結(jié)論：本文成功建立TNF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)新生SD大鼠心肌細(xì)胞肥大模型，模型的建立條件為：25 ng/ml TNF-α作用于心肌細(xì)胞24小時(shí)。
　　 第二節(jié)、Pep 3對TNF-α誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大的影響及相關(guān)信號通路研究。<

10、br>　　 研究目的：觀察Pep 3對TNF-α誘導(dǎo)乳鼠心肌細(xì)胞肥大反應(yīng)的作用，并探討TNF-α誘導(dǎo)心肌肥大反應(yīng)的機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 1、采用MTT的方法檢測細(xì)胞存活率觀察在乳鼠心肌細(xì)胞使用Pep 3的安全濃度。
　　 2、實(shí)驗(yàn)分為五組，分別為空白對照組、細(xì)胞肥大模型組、Pep 3低劑量組、Pep 3中劑量組、Pep 3高劑量組?？瞻讓φ战M不予以任何刺激，細(xì)胞肥大模型組以25 ng/ml TNF-α

11、刺激，其余三組分別以30μM、60μM和120μM的Pep 3與25 ng/ml TNF-α室溫預(yù)孵育1小時(shí)后進(jìn)行刺激。
　　 3、通過倒置相差顯微鏡觀察觀察細(xì)胞表面積和熒光定量PCR方法觀察TNF-α刺激后心肌細(xì)胞的肥大反應(yīng)以及Pep 3對其的影響，觀察Pep 3是否具有抑制心肌細(xì)胞肥大的作用。
　　 4、以Fluo-4/AM為探針，采用激光共聚焦顯微鏡(confocol microscopy)檢測心肌細(xì)胞[Ca2+]

12、i和鈣瞬變情況，探討Pep 3抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大是否與Ca/2+作用相關(guān)。
　　 5、采用熒光定量PCR和Western blot方法檢測各組細(xì)胞CaN的表達(dá)，免疫熒光方法檢測NFATc4的核轉(zhuǎn)位情況，探討Pep 3抑制TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大作用是否和CaN-NFATc4通路有關(guān)。
　　 結(jié)果：
　　 1、3 μM-270 μM的Pep 3對乳鼠心肌細(xì)胞活力沒有顯著影響。
　　 2、2

13、5 ng/ml TNF-α作用24小時(shí)可顯著誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表面積的增大[(1.78±0.2)倍，P＜0.05，vs空白對照組]，而Pep 3在30 μM-120 μM范圍內(nèi)以濃度依賴性方式抑制了抑制了TNF-α誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞表面積增大[30 μM，-93.8％，P＞0.05；60 μM，-73.0％，P＜0.05；120 μM，-69.1％，P＜0.05，vs模型組]。同時(shí)，熒光定量PCR的結(jié)果顯示，25 ng/ml TNF-α顯著誘導(dǎo)了

14、ANF、BNP mRNA在心肌細(xì)胞的表達(dá)[分別為(2.43±0.17)倍和(2.77±0.12)倍，vs空白對照組，P＜0.05]，而Pep 3預(yù)處理1小時(shí)以濃度依賴性的方式阻止了TNF-α的這種作用(30 μM，-87.1％，P＞0.05；60 μM，-73.2％，P＜0.05；120μM，-51.4％和30μM，-90.8％，P＞0.05；60 μM，-57.8％，P＜0.05；120μM，-48.6％，vs模型組，P＜0.05)。

15、
　　 3、25 ng/ml TNF-α作用于心肌細(xì)胞30分鐘，可升高舒張期細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[(1.41±0.26)倍，vs空白對照組，P＜0.05]，Pep 3預(yù)處理1 h抑制了TNF-α所致的Ca2+濃度升高(30 μM，-108％，P＞0.05；60 μM，-72.3％，P＜0.05；120μM，-67.8％，vs模型組，P＜0.05)。
　　 4、25 ng/ml TNF-α作用于心肌細(xì)胞30分鐘，可使心肌細(xì)胞

16、鈣瞬變降低，Pep 3預(yù)處理1小時(shí)抑制了TNF-α的這種作用。
　　 5、25 ng/ml TNF-α刺激24小時(shí)后CaN mRNA表達(dá)較對照組明顯增加[(1.81±0.12)倍，vs空白對照組，P＜0.05]，Pep 3預(yù)處理1小時(shí)以濃度依賴性方式抑制了TNF-α的這種作用(30 μM，-97.9％，P＞0.05；60 μM，-87.3％，P＜0.05；120 μM，-71.3％，vs模型組，P＜0.05)；CaN蛋白表達(dá)亦明

17、顯增加[(1.77±0.06)倍，vs空白對照組，P＜0.05]，Pep 3預(yù)處理1小時(shí)同樣抑制了TNF-α的這種作用(30 μM，-98.2％，P＞0.05；60μM，-86.5％，P＞0.05；120 μM，-65.0％，vs模型組，P＜0.05)。
　　 6、TNF-α刺激1小時(shí)后心肌細(xì)胞中NFATc4開始進(jìn)入細(xì)胞核。隨著刺激時(shí)間延長，發(fā)生核轉(zhuǎn)位的細(xì)胞數(shù)量增加，刺激3小時(shí)最為明顯。Pep 3預(yù)處理1小時(shí)阻止了TNF-α誘導(dǎo)