生地黃提取物對TNF-α誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　探討生地黃不同提取物對損傷血管內(nèi)皮的保護(hù)作用及作用機(jī)制，并比較95％乙醇提取物和水煎總提物對血管保護(hù)作用的強弱，同時為進(jìn)一步明確生地黃發(fā)揮血管保護(hù)作用的有效成分奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.選取體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vascular endothelial cell,HUVEC)作為研究對象，采用腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-alpha,TN

2、F-α)誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞生成血管內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell,VEC)損傷模型。
　　2. MTT比色法篩選生地黃有效部位以及各有效部位的量效、時效，并檢測對HUVEC細(xì)胞活力的影響，同時采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各有效部位對 HUVEC細(xì)胞周期的影響來探討增殖機(jī)制。
　　3.在誘導(dǎo)模型及藥物作用量效、時效都已確定的基礎(chǔ)上，采用 MTT法檢測各有效部位對 TNF-α誘導(dǎo) HUVEC細(xì)胞增殖的影響，通

3、過硝酸還原酶法檢測各部位細(xì)胞上清液中的NO及酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測 ET-1、試劑盒檢測誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的含量來探討生地黃各有效部位對內(nèi)皮功能保護(hù)作用的影響。
　　4.酶聯(lián)免疫吸附實驗檢測TNF-α誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞粘附因子、趨化因子含量來探討生地黃各有效部位對損傷血管的保護(hù)作用，吡咯烷二硫氨基甲酸鹽(PDTC)阻滯后粘附因子、趨化因子含量來探討生地黃保護(hù)血管損傷的可能作用機(jī)制。
　　5.免疫印跡法(Wester

4、n-blotting)檢測IκBα、胞漿/胞核NF-κBp65蛋白表達(dá)來探討生地黃各有效部位對NF-κB信號通路的影響。
　　結(jié)果：
　　1. MTT實驗結(jié)果顯示：生地黃提取物促HUVEC細(xì)胞增殖的有效部位是95%乙醇提取物、水煎總提物、50%甲醇部位。95%乙醇提取物、水煎總提物、50%甲醇部位最佳劑量分別為75μg·mL-1、150μg·mL-1、60μg·mL-1(P<0.01或P<0.05)，最佳作用時間均是36h(

5、P<0.01或P<0.05)。對HUVEC細(xì)胞增殖結(jié)果顯示：與對照組相比較各部位細(xì)胞存活率顯著性升高(P<0.01或 P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：與對照組相比各有效部位均可使S期比例顯著性增加(P<0.01或P<0.05)。
　　2.對TNF-α誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞增殖結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組細(xì)胞存活率明顯降低；與模型組比較，各有效部位不同濃度細(xì)胞存活率明顯增高(P<0.01或P<0.05)。檢測NO、iNOS和ET-

6、1結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組NO含量顯著降低，iNOS、ET-1含量顯著升高；與模型組相比，各給藥組均可使NO含量顯著升高，iNOS、ET-1含量顯著降低(P<0.01或P<0.05)。
　　3. ELISA檢測VCAM-1、MCP-1結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組VCAM-1、MCP-1的含量顯著性升高(P<0.01或 P<0.05)；與模型組相比，各給藥組組均可使 VCAM-1、MCP-1含量顯著性降低(P<0.01或 P

7、<0.05)。阻滯劑結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組 VCAM-1、MCP-1蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01或 P<0.05)；與模型組相比，阻滯劑組及阻滯劑和有效部位共同作用組均可使 VCAM-1、MCP-1蛋白表達(dá)顯著性下調(diào)(P<0.01或P<0.05)。
　　4. NF-κB信號通路結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組 IκBα、胞漿NF-κBp65蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，胞核蛋白NF-κBp65表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01或P<0.05)

8、；與模型組相比，各有效部位均可顯著性的上調(diào) IκBα、胞漿 NF-κBp65蛋白表達(dá)，使胞核蛋白NF-κBp65表達(dá)顯著性下調(diào)(P<0.01或P<0.05)。
　　5.對生地黃水煎總提物和95%乙醇提取物在最佳劑量和最佳時間條件下對HUVEC保護(hù)作用進(jìn)行對比研究，從檢測細(xì)胞增殖、iNOS、NO/ET-1、VCAM-1、MCP-1研究的結(jié)果顯示：與對照組相比，模型組細(xì)胞增殖顯著減少、NO降低，iNOS、ET-1增加，VCAM-1、M

9、CP-1上調(diào)；與模型組相比二部位均可使細(xì)胞增殖顯著升高、NO增加，iNOS、ET-1降低，VCAM-1、MCP-1下調(diào)，且95%乙醇提取物作用強度強于水煎總提物。
　　6.從95%乙醇提取物中沖得的50%甲醇部位為有效成分的進(jìn)一步富集部位，其主要成分為環(huán)稀醚萜類和苯乙醇苷類，提示地黃發(fā)揮血管保護(hù)作用的有效成分為環(huán)稀醚萜類和苯乙醇苷類。
　　結(jié)論：
　　1.生地黃可能通過抑制 NF-κB信號通路的激活，從而下調(diào)其下游因子