黃芪甲苷對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移的影響及作用機(jī)制.pdf

1、目的：近年來(lái)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)(percutaneous coronary intervention，PCI)已廣泛應(yīng)用于冠心病的治療，但術(shù)后再狹窄(restenosis，RS)的發(fā)生嚴(yán)重影響了其遠(yuǎn)期療效。RS的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，目前研究認(rèn)為血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)在各種刺激因素下發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，通過細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的降解由

2、血管中膜向內(nèi)膜下遷移、增殖，進(jìn)而形成新生內(nèi)膜是PCI術(shù)后再狹窄發(fā)生的關(guān)鍵性起始步驟。黃芪甲苷(AstragalosideⅣ，AS-Ⅳ)是從傳統(tǒng)中藥黃芪中分離得到的一種具有多種藥理活性的皂苷類化合物，既往研究表明AS-Ⅳ具有抗炎、抗病毒、抗氧化、抗心肌纖維化及改善心功能等作用。但目前尚未有關(guān)于AS-Ⅳ防治PCI術(shù)后再狹窄的研究。本研究通過建立體外大鼠VSMCs增殖、遷移模型，觀察AS-Ⅳ在腫瘤壞死因子（tumor necrosis fac

3、tor-α，TNF-α）的誘導(dǎo)下，對(duì)離體大鼠VSMCs增殖、遷移的影響及其作用機(jī)制，以期為PCI術(shù)后再狹窄的藥物治療提供一條新的思路。
　　方法：(1)采用組織貼塊法培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞，倒置顯微鏡和平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SM-actin)進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)和免疫組織化學(xué)鑒定，為下一步的研究提供實(shí)驗(yàn)材料。(2)以重組大鼠TNF-α(100ng/ml)作為刺激因素，建立體外平滑肌細(xì)胞增殖、遷移模型，并分組如下:①對(duì)照組;②TNF-α組;

4、③TNF-α+AS-Ⅳ0.5ug/ml;④TNF-α+AS-Ⅳ5ug/ml;⑤TNF-α+AS-Ⅳ25ug/ml;⑥TNF-α+AS-Ⅳ50 ug/ml。(3)應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)AS-Ⅳ對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的VSMCs增殖能力影響。(4)應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)AS-Ⅳ對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的VSMCs遷移、侵襲能力影響。(5)應(yīng)用Real-time PCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)AS-Ⅳ對(duì)TNF-α誘導(dǎo)的

5、VSMCs分泌的MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。
　　結(jié)果：(1)90％以上組織塊接種存活，培養(yǎng)5代的VSMCs純度達(dá)95％以上，倒置顯微鏡下可見培養(yǎng)細(xì)胞呈典型的“峰-谷”狀生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)染色后發(fā)現(xiàn)＞98％的細(xì)胞染色陽(yáng)性。(2)在TNF-α刺激下，VSMCs增殖活性、遷移距離、侵襲能力與對(duì)照組相比均明顯提高，差異顯著(P＜0.01)，提示TNF-α可促進(jìn)VSMCs的增殖、

6、遷移，成功建立了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?3)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:細(xì)胞經(jīng)TNF-α孵育至預(yù)定時(shí)間后，細(xì)胞增殖明顯，OD值上升，與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.001)。經(jīng)藥物預(yù)處理后，各濃度組細(xì)胞增殖均受到抑制，OD值降低，與同期TNF-α組相比差異顯著(P＜0.05)，且隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制更加明顯，提示AS-Ⅳ以時(shí)間和濃度依賴方式抑制了TNF-α誘導(dǎo)的VSMCs增殖。(4)劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:細(xì)胞經(jīng)TNF-α孵育至預(yù)

7、定時(shí)間后，鏡下可見VSMCs從劃痕邊緣向中間成束遷移，與對(duì)照組相比，遷移能力明顯提高(P＜0.05)。經(jīng)藥物干預(yù)后，細(xì)胞遷移距離較TNF-α組縮短(P＜0.05)，且隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加，細(xì)胞遷移距離縮短的更加明顯。提示AS-Ⅳ以時(shí)間和濃度依賴方式抑制了TNF-α誘導(dǎo)的VSMCs遷移。(5)細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TNF-α可刺激VSMCs穿過微孔濾膜，從上室進(jìn)入下室，通過細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)遷移細(xì)胞數(shù)與對(duì)照組相比，差異顯著(P＜0.01

8、)，經(jīng)藥物預(yù)處理培養(yǎng)24h后發(fā)現(xiàn):各濃度組穿膜細(xì)胞數(shù)較TNF-α組明顯減少，且具有濃度依賴性(P＜0.01)。提示:AS-Ⅳ以濃度依賴方式抑制了TNF-α誘導(dǎo)的VSMCs侵襲。(6)Real-time PCR和Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:TNF-α能夠通過誘導(dǎo)actMMP-2、MMP-9和TIMP-1的合成，對(duì)proMMP-2及TIMP-2的表達(dá)無(wú)明顯影響來(lái)改變MMPs與TIMPs的比例，進(jìn)而促進(jìn)ECM的降解。經(jīng)藥物干預(yù)后，A

9、S-Ⅳ以濃度依賴方式通過下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的MMP-2和MMP-9過表達(dá)，上調(diào)TIMP-1和TIMP-2的mRNA及蛋白表達(dá)恢復(fù)MMPs與TIMPs的比例，使ECM降解減少，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)VSMCs增殖、遷移的抑制作用。
　　結(jié)論：1.黃芪甲苷能夠以時(shí)間和濃度依賴方式抑制TNF-α誘導(dǎo)的VSMCs增殖、遷移及侵襲;2.黃芪甲苷通過下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的MMP-2和MMP-9過表達(dá)，上調(diào)TIMP-1和TIMP-2的表達(dá)恢復(fù)MMPs與TIM