鉛暴露對骨骼形成的影響及其機理研究.pdf

1、鉛是一種嚴(yán)重危害人類健康的重金屬元素，它可廣泛作用于神經(jīng)、造血、消化、泌尿和生殖系統(tǒng)。因此，鉛污染已經(jīng)受到國際社會的廣泛關(guān)注。嬰幼兒、兒童和青少年體內(nèi)的鉛負(fù)荷過重將直接影響其體格和智力發(fā)育。鈣在體內(nèi)的生物利用率與骨骼的發(fā)育有著直接的關(guān)系，那么鉛對骨骼形成的影響是否與鉛影響鈣的生物利用率有關(guān)呢?鑒于一方面鉛影響機體的生長發(fā)育，體內(nèi)的鉛75-90％沉積在骨骼，另一方面鈣作為與骨骼發(fā)育密切相關(guān)的的礦物質(zhì)，其在體內(nèi)也主要分布于(大約99％)骨骼

2、內(nèi)，因此，探討鉛與鈣的相互作用及其對骨骼形成的作用機理是一個十分重要而又有趣的課題。 本項目采用人群研究、動物實驗和細胞實驗驗相結(jié)合的方法進行。首先通過整群隨機抽樣的方法，研究重慶市2～7歲兒童體內(nèi)的鉛暴露情況，進而觀察體內(nèi)鉛負(fù)荷過重兒童體內(nèi)鈣、磷和OC的水平、形體發(fā)育及缺鈣體征(如佝僂病等)的發(fā)生情況；其次設(shè)計鉛染毒大鼠的不同鈣攝入，觀察大鼠生長發(fā)育，檢測骨骼中鉛和鈣的含量，比較大鼠股骨的顯微結(jié)構(gòu)，同時以<'45>CACl<,

3、2>示蹤研究鉛對鈣吸收的影響，測定鉛作用下大鼠OC、PTH及PTHr1表達的變化，以初步探討鉛對鈣吸收利用、骨骼形成的影響及其機理；細胞實驗則采用原代OB和骨肉瘤細胞UMR106進一步闡釋鉛對鈣及骨骼發(fā)育作用的分子學(xué)機制：鉛對OB和UMR106細胞形態(tài)和生物標(biāo)志物、OC及其調(diào)控因子的表達以及可能參與其中的MAPK(ERK1/2)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響。 本研究的主要實驗結(jié)果如下： 1．非工業(yè)區(qū)兒童身高平均為106.11cm，

4、體重為18.63kg；而工業(yè)區(qū)兒童的身高為103.74cm、體重為17.57kg。非工業(yè)區(qū)兒童體內(nèi)血鉛含量(65.29μg/L)明顯低于工業(yè)區(qū)兒童(75.29μg/L)；與之相似的是，工業(yè)區(qū)兒童發(fā)鉛含量也明顯高于非工業(yè)區(qū)兒童，但血鈣含量則剛好與兒童體內(nèi)鉛水平相反。工業(yè)區(qū)兒童血磷水平較非工業(yè)區(qū)高，但正常范圍[Ca]×[P]值(≥3.5)兒童比例明顯低于非工業(yè)區(qū)。工業(yè)區(qū)和非工業(yè)區(qū)間兒童體內(nèi)血清OC含量差異明顯，非工業(yè)區(qū)兒童體內(nèi)OC為11.2

5、2μg/L，而工業(yè)區(qū)兒童21.20μg/L。工業(yè)區(qū)和非工業(yè)區(qū)相同年齡及性別之間兒章OC含量有顯著性差異，但區(qū)內(nèi)兒童年齡及性別之間OC水平相似。統(tǒng)計分析表明，工業(yè)區(qū)和非工業(yè)區(qū)兒童體內(nèi)鉛暴露差異與兒童生長發(fā)育相關(guān)，提示鉛可能通過抑制骨骼鈣沉積和骨鈣素的分泌影響兒童的生長發(fā)育。 2．鉛染毒40d后，大鼠體重、身長和尾長的增長呈現(xiàn)如下變化：低鈣鉛處理組<鉛處理組<高鈣鉛處理組<對照組。對照組大鼠增長顯著，明顯大于高鈣鉛處理組(p<0.

6、05)，鉛處理和低鈣鉛處理組增長量則依次低于高鈣鉛處理組(p<0.05)。其中尤以雄性大鼠的變化明顯。表明鉛染毒抑制了大鼠的生長發(fā)育。 3．不同處理的大鼠股骨發(fā)育有著顯著的差異：與對照組和高鈣鉛處理組相比，低鈣鉛處理組的股骨短小，可輕易折斷。其股骨長度及干體直徑比較如下：鉛處理組>低鈣鉛處理組，但不如對照組和高鈣鉛處理組。對照組和高鈣鉛處理組股骨外形未見明顯差異；低鈣鉛處理組和鉛處理組骨干厚度明顯小于對照和高鈣鉛處理組，且低鈣鉛

7、處理組最小(p<0.01)，對照組稍大于高鈣鉛處理組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05)；低鈣鉛處理組中骨小梁數(shù)目少且散在，骨小梁間的初級骨髓腔大而形狀不規(guī)則。對照組中骨小梁數(shù)目多并相互連接，初級骨髓腔被骨小梁分開并具一定形狀。鉛處理組股骨骨小梁數(shù)較對照組和高鈣鉛處理組少，有部分連接在一起，但比低鈣鉛處理組骨小梁多。高倍鏡下可明顯看出，鉛處理和低鈣鉛處理組密質(zhì)骨沒有對照和高鈣鉛處理組致密。表明鉛處理影響了大鼠軟骨內(nèi)成骨作用，抑制大鼠骨骼

8、的正常發(fā)育，而補充鈣有助于減輕鉛對骨骼的抑制作用。 4．鉛處理組的大鼠糞便中<'45>Ca<'2+>遠遠大于對照組(P<0.01)，提示染鉛組大鼠體內(nèi)<'45>Ca<'2+>攝入遠低于對照組。各組大鼠骨鈣含量比較結(jié)果為：對照組>高鈣鉛處理組>鉛處理組>低鈣鉛處理組，而大鼠骨骼中鉛含量結(jié)果則與之相反，雌雄均呈類似趨勢。鉛處理組和低鈣鉛處理組雄性大鼠骨鉛水平相近，其余組間骨鈣和骨鉛差異顯著(p<0.05)，統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)二者呈直線負(fù)相

9、關(guān)。激光共聚焦掃描電鏡觀察Fluo-3/AM分子探針標(biāo)記的成骨細胞內(nèi)Ca<'2+>熒光時發(fā)現(xiàn)，胞內(nèi)游離Ca<'2+>濃度在鉛作用下升高。證實鉛對體內(nèi)外鈣的吸收均有著顯著的抑制作用。 5．大鼠血液OC值在對照組中最大，其次為高鈣鉛處理組，鉛處理組列第三，均高于低鈣鉛處理組，組間差異明顯。雌雄類似，但雄性中尤其明顯。與之相反的是，大鼠血液PTH含量則表現(xiàn)為低鈣鉛處理組中最高，其次為鉛處理組、高鈣鉛處理組和對照組。除雄性大鼠鉛處理和高

10、鈣鉛處理組外，其余大鼠各組間PTH含量差異極顯著。統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，大鼠OC和PTH之間并不存在直線負(fù)相關(guān)；但作散點圖分析發(fā)現(xiàn)，OC和PTH之間存在負(fù)相關(guān)的趨勢。PTHr1在低鈣鉛處理組中高表達，而在對照組中低表達，高鈣鉛處理組表達量高于對照組但低于鉛處理組。OC的表達趨勢與PTHr1相反，對照組和高鈣鉛處理組中OC高表達，低鈣鉛處理組中表達量極少，鉛處理組表達則稍多于低鈣鉛處理組。結(jié)果表明鉛影響了大鼠體內(nèi)骨相關(guān)蛋白及其受體的表達。

11、 6．大鼠股骨OB及UMR106細胞電鏡超微結(jié)構(gòu)顯示，鉛使兩類細胞結(jié)構(gòu)不同程度改變，尤其是線粒體和粗面型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)變化較大，但對于細胞膜系統(tǒng)的損傷則僅在高濃度時出現(xiàn)。結(jié)果表明鉛損傷了成骨細胞的結(jié)構(gòu)。 7．鉛使UMRl06細胞貼壁性下降，OB的形態(tài)發(fā)生改變。OB和UMR106細胞ALP、Collagen Ⅰ隨鉛濃度的增加而表達減少，提示鉛影響了成骨細胞的形態(tài)及標(biāo)志物的表達；鉛降低了成骨細胞OC的分泌，并使OC的調(diào)節(jié)因子如bF

12、GF、cbfa1/osf2、c-fos和c-jun的表達減少；鉛明顯促進p-ERK1/2的表達，ERK1/2途徑的特異性阻斷劑PD98059可使鉛對UMR106的這種作用減弱或消失，但對于總ERK1/2的表達并無影響。表明MAPK(ERK1/2)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能參與了鉛對成骨細胞毒性作用的調(diào)控。 綜上所述,鉛抑制了骨骼的正常生長發(fā)育，低鈣處理加劇了其作用，而適量的鈣補充有利于減輕鉛對于骨骼生長的抑制作用。鉛對于骨骼生長發(fā)育的