鉛暴露對(duì)大鼠腦海馬CaMKⅡ及下游信號(hào)分子的影響機(jī)制研究.pdf

1、本研究在前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上擬觀察鉛對(duì)CaMK．Ⅱ在學(xué)習(xí)記憶中的影響，證明其與ERK1/2、CREB等在長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(Long Term Potentiation， LTP)中的關(guān)系，為學(xué)習(xí)記憶機(jī)理的研究提供有力依據(jù)，將鉛中毒作用機(jī)制的研究進(jìn)一步深入，為優(yōu)生優(yōu)育，提高國(guó)民素質(zhì)提供理論依據(jù)。 研究方法： 1、急性鉛暴露的方法如下： 利用頸部脫臼法處死大鼠，迅速取出腦海馬，放到預(yù)冷并通以95％O<,2>+5％CO<,2

2、>的人工腦脊液(Artificial cerebrospinal fluid，ACSF)中，將腦海馬切成350μm厚的腦片。在穩(wěn)定培養(yǎng)2 h后，對(duì)其進(jìn)行醋酸鉛或谷氨酸及KN-93處理，在0，3，7．5，15，30，60，120min收集腦片。利用磷酸化及非磷酸化抗體，Westem blots方法測(cè)定ERK2和CREB活性及表達(dá)；利用RT-PCR方法測(cè)定CaMKⅡmRNA表達(dá)水平。觀察鉛對(duì)腦片ERK2和CREB活性及表達(dá)的影響。

3、2、體內(nèi)慢性鉛暴露的方法如下： Wistar大鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大鼠受孕后隨機(jī)分為染鉛組和對(duì)照組。染鉛組飲用0.2％醋酸鉛水溶液，對(duì)照組飲用自來(lái)水。各自持續(xù)整個(gè)妊娠期和哺乳期。為確保仔鼠具有相同的營(yíng)養(yǎng)條件，每只母鼠最多哺育8只仔鼠。于20 d仔鼠斷乳后，染鉛組仔鼠直接飲用與母鼠相同鉛濃度的水溶液。對(duì)照組仔鼠直接飲用自來(lái)水。于仔鼠斷乳第一天(即20 d)起始，再分別于40 d、60 d、80 d，將仔鼠頸部脫臼法處死

4、，迅速取出海馬，放入液氮中，此為慢性鉛暴露組及對(duì)照組海馬標(biāo)本。利用非磷酸化抗體，Western blots方法測(cè)定ERK2及CREB表達(dá)量，觀察鉛對(duì)海馬總量ERK2及總量CREB表達(dá)的影響。 研究結(jié)果： 1、急性鉛暴露對(duì)腦片ERK2活性(即pERK2)的影響急性鉛暴露的腦片培養(yǎng)過(guò)程中，在ACSF中醋酸鉛濃度為20μmol/L，于0，3，7.5，15，30，60，120 min時(shí)間點(diǎn)收集腦片，利用磷酸化抗體，Western

5、 blots結(jié)果顯示早期ERK2活性升高，30 min處降至最低，以后向正?；謴?fù)。 2、急性鉛暴露對(duì)腦片總量ERK2表達(dá)的影響在醋酸鉛濃度為20μmol/L的ASCF培養(yǎng)中，于前述相同時(shí)間點(diǎn)收集腦片，利用非磷酸化抗體，Western blots結(jié)果顯示總量ERK2表達(dá)未受影響。 3、慢性鉛暴露對(duì)總量ERK2表達(dá)的影響慢性鉛暴露狀態(tài)下的新生仔鼠分別于20 d，40 d，60 d，80 d頸脫臼法處死，利用非磷酸化抗體，We

6、stern blots結(jié)果顯示總量ERK2表達(dá)降低。 4、急性鉛暴露對(duì)腦片CREB活性(即pCREB)及總量CREB表達(dá)的影響急性鉛暴露腦片培養(yǎng)過(guò)程中，在ACSF中醋酸鉛濃度為20μmol/L，于0，3，7.5，15，30，60，120min時(shí)間處收集腦片，利用磷酸化抗體，Western blots結(jié)果顯示CREB活性呈時(shí)間依賴性降低。 與測(cè)定CREB活性的相同時(shí)間點(diǎn)收集腦片，利用非磷酸化抗體，Westernblots結(jié)

7、果顯示總量CREB表達(dá)未受影響。 5、慢性鉛暴露對(duì)腦片總量CREB表達(dá)的影響慢性鉛暴露狀態(tài)下的新生仔鼠分別于20 d，40 d，60 d，80 d頸脫臼法處死，利用非磷酸化抗體，Western blots結(jié)果顯示總量CREB表達(dá)未受影響。 6、急性鉛暴露對(duì)CaMKⅡ mRNA水平影響腦片培養(yǎng)過(guò)程中的鉛暴露，對(duì)CaMKⅡ的mRNA水平?jīng)]有明顯影響。 7、CaMIⅡI抑制劑KN-93處理腦片，對(duì)ERK2活性及表達(dá)的影

8、響在腦片培養(yǎng)過(guò)程中，經(jīng)CaMKⅡ抑制劑KN-93處理，利用磷酸化及非磷酸化抗體，Westem blots結(jié)果顯示KN-93能降低谷氨酸引起的ERK2活性的升高，總量ERK2表達(dá)未受影響。 8、CaMKⅡ抑制劑KN-93處理腦片，對(duì)CREB活性及表達(dá)的影響在腦片培養(yǎng)工程中，經(jīng)CaMKⅡ抑制劑KN-93處理，利用磷酸化及非磷酸化抗體，Western blots結(jié)果顯示KN-93能降低谷氨酸引起的CREB活性的升高，總量CREB表達(dá)未