類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路阻斷劑的制備及其功能研究.pdf

1、盤狀結(jié)構(gòu)域受體(discoidin domain receptors，DDRs)屬于一種受體型蛋白酪氨酸激酶，蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，PTKs)是一大類介導(dǎo)細(xì)胞增殖或凋亡的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。DDRs分子不僅與細(xì)胞增殖相關(guān)，還與細(xì)胞過分泌MMPs相關(guān)。它參與了許多細(xì)胞生理進(jìn)程，如細(xì)胞增殖、分化、遷移和代謝，尤其是在控制軟骨細(xì)胞增殖和骨骼生長中發(fā)揮重要作用。DDR2是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumato

2、id arthritis，RA)病理進(jìn)程中起重要作用的分子之一。在RA滑膜細(xì)胞中，DDR2呈高表達(dá)狀態(tài)，并具有較高的的磷酸化水平。它被膠原活化，介導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo- proteinases，MMPs)的表達(dá)，MMPs作用于關(guān)節(jié)軟骨，最終造成關(guān)節(jié)軟骨不可逆的破壞。因此，本研究制備了Ⅱ型膠原-DDR2-MMPs這一信號(hào)通路的阻斷劑，使其阻斷DDR2介導(dǎo)的MMPs持續(xù)分泌，期望將來為臨床上治療RA提供新的候選藥物

3、。本研究主要取得了以下結(jié)果： 1．成功構(gòu)建了DDRs/IgG融和表達(dá)載體，并在HEK293細(xì)胞和CHO細(xì)胞中進(jìn)行了表達(dá)鑒定。本實(shí)驗(yàn)對(duì)DDR2的DS domain與IgG的Fc段進(jìn)行了融合表達(dá)，DS domain是DDRs結(jié)合其配體——Ⅱ型膠原的有效區(qū)域，之所以將它和Fc段進(jìn)行融合，目的是利用Fc的二硫鍵使DDR2 DS domain形成二聚體，使其具備與Ⅱ型膠原結(jié)合的構(gòu)象，通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Ⅱ型膠原而抑制它與天然受體結(jié)合，進(jìn)而阻斷Ⅱ

4、型膠原-DR2-MMPs這一信號(hào)通路。 2．利用CHO細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和壓力篩選，獲得了強(qiáng)表達(dá)DDR2/Fc融合蛋白的單克隆細(xì)胞株。 3．通過大量培養(yǎng)陽性細(xì)胞株，收集培養(yǎng)上清后，利用蛋白A親和層析，對(duì)融合蛋白進(jìn)行回收與純化，結(jié)果表明蛋白表達(dá)量在1.14 μ g/mL (7.98 μ g/10<'7>cell)。 4．經(jīng)過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證明制備出的競(jìng)爭(zhēng)性阻斷劑——DDR2/Fc融合蛋白在體