第二代惡性瘧原蟲多表位人工抗原疫苗的構(gòu)建和篩選.pdf

1、瘧疾是世界上最嚴重的傳染病之一，2008年有2.43億人感染瘧原蟲，約86.3萬人因患瘧疾死亡，而惡性瘧原蟲是造成嚴重危害的主要“元兇”。近年來，雖然在“瘧疾控制”方面取得了顯著的成績，但對于預防性和治療性瘧疾疫苗的需求仍十分迫切。目前，針對瘧原蟲生活史復雜，抗原的表達具有階段特異性、高度變異性等特點，亞單位、多表位嵌合疫苗成為抗惡性瘧疫苗的研究熱點。
　　 前期研究中，本實驗室發(fā)明了“表位改組”技術(shù)，利用其構(gòu)建了具有極高表位連

2、接多樣性的多表位基因文庫，并篩選出了高免疫原性和體外抑制瘧原蟲生長能力的第一代多表位嵌合抗原M.RCAg-1，證實了“表位改組”技術(shù)的可行性。但是，由于其N端帶有載體來源的43肽以及6×His蛋白標簽，雖然能夠用腸激酶（EK）切除，但成本過高，限制了M.RCAg-1的研究價值。
　　 本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，進行了一系列改進，包括：選擇了12個以惡性瘧原蟲紅內(nèi)期主要的疫苗候選抗原為主的15個B細胞和Th細胞表位；在表位連接處引

3、入特定的間隔序列：在多表位抗原的N、C端固定引入抗原側(cè)翼序列FN和FC；所有多表位抗原序列均為瘧原蟲來源，不含任何載體肽和蛋白標簽，符合國家《人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術(shù)指導原則》的標準規(guī)范。構(gòu)建并篩選得到了第二代多表位嵌合抗原疫苗。與此同時，通過對多表位嵌合抗原序列（表位）組成、二級結(jié)構(gòu)、免疫原性和瘧原蟲體外生長抑制率（GIA）水平的對比分析，初步探討了幾個參數(shù)間的關(guān)系。此外，建立了以C端固定肽的特異性多克隆IgY抗體為配基的免疫親

4、和層析，為文庫中多表位嵌合抗原的高效純化探索了新的途徑。
　　 主要取得以下進展：
　　 1.成功構(gòu)建并得到具有高免疫原性和表位連接多樣性的第二代多表位嵌合基因文庫，同時其小鼠免疫血清對培養(yǎng)惡性瘧原蟲天然蛋白具有識別多樣性。
　　 2.從基因文庫中篩選得到高免疫原性嵌合抗原D10，免疫大白兔后，總IgG和特異性IgG的GIA水平分別為47％和67％，高于陽性對照抗原MSPl抗體的44％。此外，對72份疫區(qū)患者血清

5、的篩查發(fā)現(xiàn)，對D10抗原的識別率達到67％，且與患者蟲血率顯著負相關(guān)，提示D10可能與惡性瘧疾保護有關(guān)。表明全序列為瘧原蟲來源的嵌合抗原D10，具有繼續(xù)優(yōu)化開發(fā)的價值。
　　 3.我們發(fā)現(xiàn)多表位嵌合抗原二級結(jié)構(gòu)中的“Coil-Helix-Coil-Helix”結(jié)構(gòu)影響抗原的免疫原性；同時，也發(fā)現(xiàn)含有“連續(xù)4個Th細胞表位”結(jié)構(gòu)的多表位嵌合抗原具有更高的GIA水平。
　　 4.證實了在多表位嵌入肽段抗體中，抑制性和促進性抗

6、體的存在，并推斷其以級聯(lián)或協(xié)同的方式影響總抗體的GIA水平。
　　 5.通過制備C端融合序列的特異性多克隆IgY抗體，建立了免疫親和純化文庫多表位嵌合抗原的新途徑。
　　 6.證實了基于Hydroethidine染料的流式細胞術(shù)，可以作為惡性瘧原蟲蟲血率及其生長周期的相對定量分析方法，并將其工作濃度優(yōu)化為10μg/ml。
　　 本研究利用部分改進的“表位改組”技術(shù)，構(gòu)建并篩選得到了具有較大開發(fā)價值的多表位嵌合抗原