SYBR Green實時PCR檢測惡性瘧原蟲與間日瘧原蟲方法的建立.pdf

1、目的:建立一種檢測惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲的SYBR Green實時PCR法，并將建立的方法進行初步臨床應用。
　　方法:1.針對惡性瘧原蟲與間日瘧原蟲18S rRNA基因設計2對（3條）外引物和2對（3條）內(nèi)引物，建立可同時擴增出惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲特異性片段的多重巢式PCR方法，并進行敏感性、特異性評價和臨床標本檢測。2.利用上述巢式引物進行SYBR Green實時PCR反應，同時進行熔解曲線和Tm值分析。優(yōu)化實時PCR的反應

2、體系與反應條件，檢測該方法的敏感性、特異性和重復性并進行臨床標本檢測。
　　結(jié)果:1.多重巢式PCR可同時擴增出惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲的18S rRNA基因片段長度分別為162bp（惡性瘧原蟲），112bp(間日瘧原蟲)，并能檢出混合感染，該實驗檢測間日瘧原蟲的靈敏度為101copies/μl。特異性實驗結(jié)果顯示每對引物只檢測對應的蟲種，54份臨床標本的檢測結(jié)果與鏡檢法無差別(P＞0.05)，敏感度為97.30％，特異度為5.88

3、％。2.SYBR Green實時PCR構(gòu)建的熒光定量標準曲線循環(huán)閾值與模板濃度呈現(xiàn)良好的線性關系，擴增效率為101.884％，檢測靈敏度為101copies/μl，從提取DNA到完成檢測只需3小時，重復性好。該方法與三日瘧原蟲及卵形瘧原蟲無交叉反應，對臨床標本的檢測結(jié)果與多重巢式PCR檢測結(jié)果一致。
　　結(jié)論:1.本研究建立的多重巢式PCR方法可同時檢測惡性瘧原蟲與間日瘧原蟲，敏感性高，特異性強，可用于基層部門對瘧疾的檢測與惡性瘧