特異性抑制survivin基因表達(dá)對胃癌放、化療的增敏作用.pdf

1、【引言】在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，細(xì)胞增殖與凋亡失衡是其一個重要機制，凋亡受阻也是導(dǎo)致對腫瘤細(xì)胞的各種治療療效耐受的重要原因之一。凋亡過程涉及多條反應(yīng)途徑和多個調(diào)節(jié)因子，機制非常復(fù)雜，而凋亡蛋白抑制因子（inhibitorofapoptosisprotein，IAP）家族就是其中非常重要的一類抗凋亡因子，其結(jié)構(gòu)的共同點是在它的N端含有一個或者是多個桿狀病毒IAP重復(fù)序列（baculovirusIAPrepeat，BIR）串聯(lián)在一起，而C

2、端含或不含有一個環(huán)指（RINGfinger）結(jié)構(gòu)。Survivin是IAP家族中的一個重要成員，多年來的研究表明，其在人類多種惡性腫瘤中均存在高表達(dá)，具有強大的抗細(xì)胞凋亡功能，與包括胃癌、卵巢癌等等在內(nèi)的多種人類腫瘤的形成、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，其異常的表達(dá)水平升高極有可能是導(dǎo)致多種人類惡性腫瘤對化療耐藥和放療抵抗的重要原因。
　　RNAi（RNAinterference）是由導(dǎo)入的雙鏈RNA（doublestrandRNA，dsR

3、NA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象，最早由法爾和梅洛于1998年發(fā)現(xiàn)，廣泛存在于地球上的高等植物和動物中。RNAi的機制是將dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，dsRNA隨后被Dicer酶(一種RNA酶)Ⅲ剪切，形成具有雙鏈的小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA），siRNA可與RNA誘導(dǎo)的基因沉默復(fù)合物相互結(jié)合，從而降解靶向mRNA（與siRNA的堿基序列呈互補關(guān)系），特異性的抑制靶基因表達(dá)。RNAi技術(shù)具有

4、簡便易行、特異高效的特點，被《Science》雜志評為2001年的十大科學(xué)進(jìn)展之一，并名列2002年十大科學(xué)進(jìn)展之首，已被廣泛用于探索基因功能和惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域
　　胃癌是我國常見的惡性腫瘤之一，在我國，發(fā)病率居各類常見良惡性腫瘤的首位。盡管我國對胃癌的預(yù)防和治療已取得很大成果，但近年來隨著社會生活水平的提高、工作節(jié)奏的增加等等原因，胃癌的發(fā)病率呈有增高趨勢。在胃的惡性腫瘤中，腺癌占95％。因為胃癌易發(fā)生直接播散、血液轉(zhuǎn)移和

5、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，所以中晚期胃癌往往不能手術(shù)根治；而胃癌（尤其是腺癌）對放療的敏感性較差，對化療又容易產(chǎn)生耐藥，故治療難度往往大，預(yù)后也不是很理想。因此，尋找科學(xué)和可行的多種治療途徑增強放療和化療的療效，從而改善預(yù)后，業(yè)已成為普通外科領(lǐng)域的熱點研究問題。
　　【目的】觀察survivin基因表達(dá)下調(diào)對胃癌放、化療敏感性的影響，探討survivin基因RNA干擾對胃癌放、化療增敏的效果和可能的機制，為以survivin為靶基因治療胃癌提供

6、實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　【方法】本研究分為五個部分：
　　1、構(gòu)建survivin基因RNA干擾載體，檢測其對胃癌SGC7901細(xì)胞survivin基因表達(dá)的干擾效果。
　　根據(jù)RNAi設(shè)計原則，以及查得的survivin基因的編碼序列，設(shè)計、合成2對survivin特異性siRNA引物（S1-1，2；S2-1，2）及1對對照引物（NC-1，NC-2），退火連接，將其分別克隆入真核表達(dá)載體pEGFP-C1，經(jīng)測序鑒定

7、無誤，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞系SGC7901（胃癌），通過G418篩選陽性克隆，利用半定量RT-PCR、Westernblot等技術(shù)從mRNA及蛋白表達(dá)水平檢測survivin基因抑情況，篩選干涉效果最好的survivinsiRNA載體以及穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行實驗研究。
　　2、特異性抑制survivin基因表達(dá)可提高SGC7901細(xì)胞對放、化療的敏感性。
　　用MTT法繪制細(xì)胞生長曲線，平板克隆形成實驗和多靶單擊模型擬合細(xì)胞存活曲線

8、以觀察SGC7901細(xì)胞在不同照射劑量下對X線放射治療敏感性的變化；MTT比色法檢測2GyX線照射24h、48h和72h后細(xì)胞的生長抑制情況。順鉑、5-FU作用48小時后，用MTT比色法檢測50％抑制濃度（IC50）。5ug/ml順鉑、10ug/ml5-FU作用24h、48h和72h后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率。
　　3、特異性抑制survivin基因表達(dá)對胃癌裸鼠皮下移植瘤模型放、化療的增敏作用。<

9、br>　　直接細(xì)胞懸液接種法在裸鼠皮下建立SGC7901-S1、SGC7901-NC和SGC7901三種胃癌細(xì)胞的移植瘤模型，對比不同胃癌細(xì)胞的成瘤能力。分別用2GyX線、2mg/kg順鉑和25mg/kg5-FU對胃癌裸鼠皮下移植瘤模型進(jìn)行放療和化療，通過測量、繪制移植瘤體積生長曲線，處死后稱取移植瘤瘤重，觀察抑制survivin基因表達(dá)對移植瘤放、化療的增敏作用。
　　4、特異性抑制survivin基因的表達(dá)對胃癌細(xì)胞化療增敏作

10、用的機制研究。
　　5ug/ml順鉑作用24h、48h和72h后，流式細(xì)胞儀PI單染色法檢測細(xì)胞周期變化，AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，DNA瓊脂糖凝膠電泳分析、TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡改變。
　　【結(jié)果】
　　1．成功構(gòu)建了survivinRNA干擾載體pEGFP-C1-S1、pEGFP-C1-S2和對照載體pEGFP-C1-NC；建立了3組穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系：SGC7901-S1、S

11、GC7901-S2、SGC7901-NC。
　　2．SGC7901-S1、SGC7901-S2細(xì)胞中survivinmRNA和蛋白表達(dá)均下調(diào)，尤其以pEGFP-C1-S1的干涉效果為好，其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系SGC7901-S1中mRNA和蛋白表達(dá)的抑制率分別為：58.7％和55.8％。
　　3．隨X線放射治療的照射劑量升高，SGC7901-S1、SGC7901-NC、SGC7901細(xì)胞的克隆形成率出現(xiàn)下降。同一劑量照射下，SGC

12、7901-S1細(xì)胞的克隆形成率較其他細(xì)胞顯著降低，細(xì)胞存活曲線顯示：SGC7901-S1D0、Dq值顯著下降，分別為：2.457、1.471，其放射增敏比（SER）分別為：1.176（D0值比）、1.347（Dq值比）；2GyX線照射后各組細(xì)胞的凋亡率和生長抑制率隨著時間的延長有著明顯的提高，各檢測點SGC7901-S1細(xì)胞凋亡率和生長抑制率明顯高于其它兩組細(xì)胞。
　　4．隨著順鉑、5-FU藥物濃度升高，SGC7901-S1、SG

13、C7901-NC、SGC7901細(xì)胞的存活率出現(xiàn)下降。在同一藥物濃度下，SGC7901-S1細(xì)胞存活率下降更明顯。MTT法測得順鉑處理72小時的IC50值為5.61±0.32ug/ml，5-FU處理72小時的IC50值為8.91±0.39ug/ml。隨著時間的延長，5ug/ml順鉑或10ug/ml5-FU處理后的細(xì)胞凋亡率和生長抑制率出現(xiàn)增加，各檢測點SGC7901-S1的細(xì)胞凋亡率和生長抑制率明顯高于SGC7901-NC、SGC790

14、1細(xì)胞。
　　5．成功建立3組人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，成瘤率100％。3組的平均成瘤時間分別為：SGC7901組裸鼠7.55±0.38天，SGC7901-NC組裸鼠7.38±0.48天，SGC7901-S1組裸鼠15.33±0.58天。
　　6．X線放療后不同檢測點接種SGC7901-S1組裸鼠腫瘤體積明顯小于接種SGC7901-NC、SGC7901組，腫瘤生長明顯受抑。觀察結(jié)束后，接種SGC7901-S1組裸鼠瘤重明顯小

15、于接種SGC7901-NC、SGC7901組，分別為1.623±0.248g、2.725±0.332g和2.831±0.356g（P<0.05）。
　　7．順鉑化療后不同檢測點接種SGC7901-S1組裸鼠腫瘤體積明顯小于接種SGC7901-NC、SGC7901組，腫瘤生長明顯受抑。觀察結(jié)束后，接種SGC7901-S1、SGC7901-NC、SGC7901組裸鼠瘤重分別為1.358±0.258g、2.782±0.371g和2.72

16、7±0.373g（P<0.05）。相似的情況也出現(xiàn)在5-FU化療后，觀察結(jié)束后，接種SGC7901-S1組裸鼠瘤重明顯小于接種SGC7901-NC、SGC7901組，分別為1.228±0.215g、2.753±0.347g和2.801±0.382g（P<0.05）。
　　7.流式細(xì)胞儀檢測化療后各組細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，SGC7901-S1組細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯，細(xì)胞比例明顯高于SGC7901-NC、SGC7901組。
　　

17、8．AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記檢測結(jié)果顯示，化療后SGC7901-S1組的凋亡比例明顯高于SGC7901-NC、SGC7901組。
　　9.DNA瓊脂糖凝膠電泳分析SGC7901組細(xì)胞核的DNA裂解為大小約為180-200bp（及其整數(shù)倍）的寡核苷酸片斷，電泳圖譜呈現(xiàn)明顯的階梯狀(DNAladder)。
　　10．TUNEL熒光染色法檢測細(xì)胞凋亡，SGC7901-S1組陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯增加，表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)強

18、的黃綠色熒光。
　　【結(jié)論】
　　1．成功構(gòu)建并篩選出干涉效果較好的survivinRNA干涉載體，并篩選出相應(yīng)的人胃癌穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系SGC7901-s1，經(jīng)檢測其對survivin基因mRNA和蛋白的表達(dá)干擾效果較好。
　　2．體外實驗證明，特異性抑制survivin基因的表達(dá)可顯著增強胃癌細(xì)胞SGC7901對X線放射治療和順鉑、5-FU化療的敏感性。
　　3．成功建立3組人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，通過體內(nèi)實驗

19、證明，特異性抑制survivin基因的表達(dá)可增強X線放射治療和順鉑、5-FU化療對移植瘤的生長抑制，提高移植瘤的放、化療敏感性。
　　4．特異性抑制胃癌細(xì)胞survivin基因的表達(dá)后，化療細(xì)胞出現(xiàn)了顯著的G2/M期阻滯和凋亡現(xiàn)象，說明抑制survivin的表達(dá)對胃癌細(xì)胞放、化療增敏作用的機制，可能跟survivin調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程、誘導(dǎo)凋亡的作用有關(guān)。這為今后明確survivin的調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用及影響放化療敏感性等通路中的可