激活態(tài)雪旺細胞臨床應用安全性的實驗研究.pdf

1、引言:組織工程為周圍神經缺損的修復提供了新的方法,填充了雪旺細胞的可吸收人工神經導管有望在將來替代自體神經移植應用于臨床。通過“激活液”(專利申請中)外源性刺激獲得的激活態(tài)雪旺細胞,在增殖能力和分泌活性都明顯超過正常的雪旺細胞,而且促進神經再生的效果也明顯增強。體外培養(yǎng)、擴增的激活態(tài)雪旺細胞應用于臨床的一個必要前提是安全可靠,無致癌性、致畸性。本研究的目的是聯(lián)合體內、體外多個實驗,檢測激活態(tài)雪旺細胞是否安全,有無應用于臨床的可能。本研究

2、共分為4個部分:
　　第一部分，培養(yǎng)成年大鼠雪旺細胞的關鍵技術的比較研究
　　目的:通過橫向比較,探索適合臨床應用的成年雪旺細胞培養(yǎng)技術。
　　方法:成年SD大鼠,分4組,每組10只,從雙側坐骨神經取材培養(yǎng)雪旺細胞。A組采用體內預變性法+快速酶消化法;B組采用體內預變性法+慢速酶消化法;C組采用體外預變性法+快速酶消化法;D組采用體外預變性法+慢速酶消化法。細胞傳代使用冷噴射傳代法和胰酶消化傳代法。比較(1)體內、體外

3、預變性增加取材神經中雪旺細胞的數(shù)目有無差別;(2)快速、慢速酶消化法從神經中獲取雪旺細胞的效率;(3)冷噴射傳代法和胰酶消化傳代法的效率。篩選使動物痛苦小、而雪旺細胞數(shù)量多、純度高等最適合臨床應用的方法。
　　結果:體外預變性和體內預變性都能明顯增加取材神經中的雪旺細胞數(shù)目,無統(tǒng)計學差異,但體外預變性減輕了患者的痛苦。快速酶消化法和慢速酶消化法在培養(yǎng)1周時獲得的雪旺細胞數(shù)目相似,無統(tǒng)計學差異。冷噴射傳代法兼有純化雪旺細胞的作用,會

4、損失一定數(shù)量的雪旺細胞,對操作者技術要求高;胰酶消化傳代法沒有純化的作用,對操作者技術要求低。
　　結論:體外預變性減輕患者痛苦,更適合臨床應用;快速、慢速酶消化法效果無明顯差異,均可考慮應用;冷噴射傳代法可以和胰酶消化傳代法有機結合使用,前者在雪旺細胞純度較低時應用,后者在雪旺細胞純度較高時應用。
　　第二部分，激活態(tài)雪旺細胞體外生物學特性的實驗研究
　　目的:體外檢測激活態(tài)雪旺細胞的生物學特性,與良性、惡性細胞對比

5、,分析其是否有惡性細胞的特點。
　　方法:從成年大鼠坐骨神經中分離并體外培養(yǎng)激活態(tài)雪旺細胞,通過對細胞形態(tài)的連續(xù)觀察、生長方式的變化、免疫學標志物鑒定、增殖率和純度檢測、遷移能力和侵襲能力檢測、染色體核型分析,及全基因組表達譜基因芯片、細胞因子抗體芯片檢測,對激活態(tài)雪旺細胞的生物學特性進行綜合評估。
　　結果:激活態(tài)雪旺細胞在體外培養(yǎng)形態(tài)均一、無異質性變化。增殖能力增加,受密度抑制影響減小。連續(xù)傳代不丟失S100、P75LN

6、GFR、GFAP等免疫學標識物,遷移能力、侵襲能力略有增加,但明顯弱于惡性細胞。染色體仍為2倍體。基因和蛋白表達存在動態(tài)平衡,第2、3代總體表達最高。
　　結論:從成年大鼠周圍神經分離并體外培養(yǎng)獲得的激活態(tài)雪旺細胞,基本不具備惡性細胞的生物學特性。
　　第三部分，激活態(tài)雪旺細胞自體移植后的體內過程
　　目的:模擬臨床應用,探索激活態(tài)雪旺細胞的體內變化過程,是否會形成腫瘤。
　　方法:從成年大鼠雙側坐骨神經培養(yǎng)足量

7、的激活態(tài)雪旺細胞,移植到自體腋窩下,與良性、惡性細胞移植對比。50只成年大鼠分三組:A組:激活態(tài)雪旺細胞,自體移植細胞數(shù)目1×107個,大鼠20只;B:正常雪旺細胞,自體移植細胞數(shù)目1×107個,大鼠20只;C組,惡性大鼠膠質瘤C6細胞,移植細胞數(shù)目2×106個,大鼠10只。分別在移植細胞后0.5個月、1個月、2個月、4個月、6個月對大鼠腋窩注射細胞處取材,觀察大體標本上是否有細胞團或腫瘤形成,解剖局部及內臟觀察有無腫瘤轉移灶的形成。將

8、局部的細胞團塊或腫瘤做免疫組織化學鑒定,并查找病理性核分裂相。
　　結果:注射惡性細胞的大鼠(C組),均在0.5～1個月長出腫瘤。而激活態(tài)雪旺細胞組(A組)和正常雪旺細胞組(B組)在體內不形成腫瘤,體內的過程相似,至少可以在腋窩下存活2個月,并表達免疫學標志物。
　　結論:激活態(tài)雪旺細胞在體內非正常微環(huán)境下至少可以存活2個月,并表達免疫學標志物,不形成腫瘤。
　　第四部分，激活態(tài)雪旺細胞自體移植對后代影響的實驗研究

9、r>　　目的:探索激活態(tài)雪旺細胞自體移植是否對后代產生影響。
　　方法:從成年雌性動物坐骨神經培養(yǎng)出足量的激活態(tài)雪旺細胞后自體移植,然后與雄性大鼠同籠喂養(yǎng)3個月。與單純坐骨神經切除的動物對比后代的生物學性狀,如懷孕率,新生鼠的活胎數(shù)、死胎數(shù)、體重、體長、尾長的比較,染色體數(shù)目的檢測。新生鼠4周時的發(fā)育、基本行為能力、對傷害的認知等。結果:無論是否移植激活態(tài)雪旺細胞,單側坐骨神經切除后的成年雌性大鼠,3個月內懷孕率均為40％。實驗組