轉錄因子stat3調控激活態(tài)雪旺細胞基因表達的研究.pdf

1、引言:對周圍神經損傷伴缺損的治療仍是外科領域的一個難題,目前主要是通過自體神經移植進行缺損段的修復,這種治療方法本身存在一些不足。組織工程化人工神經為周圍神經缺損修復提供了新的手段,隨著組織工程材料研究的不斷發(fā)展和對于組織工程神經認識的不斷深入,使得組織工程化人工神經的發(fā)展成為一個非常有前景的領域。而激活態(tài)雪旺細胞(activated Schwann cell ASC)作為一種優(yōu)良的組織工程種子細胞,具有高增值,高分泌某些神經營養(yǎng)因子活

2、性,能夠有效促進周圍神經再生。對該細胞生物學活性的系統研究,是人工神經研究的另一個熱點。本課題從轉錄因子、基因水平上對激活態(tài)雪旺細胞進行研究,尋找激活態(tài)雪旺細胞優(yōu)于正常態(tài)雪旺細胞(normal Schwann cell NSC)的生物活性的原因。共分為三個部分:第一部分使用黑素細胞培養(yǎng)基改良成年大鼠雪旺細胞培養(yǎng)方法目的尋找簡單、快速獲得高純度雪旺細胞的方法。
　　方法:20只預變性一周的成年SD大鼠,重150克,取其坐骨神經,經0

3、.25％胰酶,0.1%膠原酶分次酶消化30分鐘后。分別使用DMEM/F12培養(yǎng)基(A組)和黑素細胞培養(yǎng)基(B組)進行培養(yǎng)。冷噴射(coldjet)方式傳代。S-100染色鑒定并計算雪旺細胞純度。結果:采用黑素細胞培養(yǎng)基組的雪旺細胞純度達到90%以上,細胞收獲量遠高于采用DMEM/F12培養(yǎng)基的對照組。而對照組的雪旺細胞純度僅能保持在30%左右。結論:使用黑素細胞培養(yǎng)基及冷噴射傳代操作簡單,可以在短期內獲得足量高純度的雪旺細胞。第二部分應

4、用轉錄因子蛋白/DNA組合芯片檢測激活態(tài)/正常態(tài)雪旺細胞的活性轉錄因子表達水平的差異目的檢測激活態(tài)/正常態(tài)雪旺細胞活性轉錄因子及其表達水平上的差異。方法應用轉錄因子蛋白/DNA組合芯片技術檢測激活態(tài)/正常態(tài)雪旺細胞的活性轉錄因子。
　　結果:激活態(tài)雪旺細胞和正常態(tài)雪旺細胞的轉錄因子芯片點陣圖顯示:激活態(tài)雪旺細胞與正常態(tài)雪旺細胞相比,有6個轉錄因子蛋白上調5倍以上,它們是PEPCK promoter GR、NF-E2(2)、Stat

5、3、NFE-6/CP1、PRDII-BF1和NFkB(2);這些表達顯著增加的轉錄因子,可能就是激活態(tài)雪旺細胞增殖活性高重要的原因;結論6個轉錄因子蛋白上調都與激活態(tài)雪旺細胞的快速分裂、高分泌狀態(tài)密切相關。第三部分染色質免疫沉淀結合芯片技術檢測轉錄因子stat3調控激活態(tài)雪旺細胞/正常態(tài)雪旺細胞基因表達目的檢測轉錄因子stat3調控激活態(tài)雪旺細胞/正常態(tài)雪旺細胞哪些基因的表達,發(fā)現ASC/NSC在基因表達水平的差異方法采用染色質免疫沉淀

6、結合芯片技術對ASC/NSC基因組進行高通量篩選結果經過對ASC/NSC全基因組385,000個位點進行掃描后,發(fā)現有361種基因在ASC/NSC中都與轉錄因子stat3發(fā)生結合。另有122種基因,僅在ASC中與stat3結合,而NSC中這些基因并不與stat3發(fā)生作用。其中的一些基因如:Atoh1、bex1、F2RL1、polg、Rcan2主要參與細胞周期、凋亡和成髓的調控。
　　結論:僅在ASC中與轉錄因子stat3發(fā)生作用的