糞腸球菌生物膜形成及藥物控制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分根管內(nèi)糞腸球菌生物膜的形成研究 目的： 從根管治療失敗患牙的感染根管內(nèi)分離、鑒定糞腸球菌；建立糞腸球菌根管內(nèi)感染體外模型，觀察根管內(nèi)糞腸球菌生物膜的形成。 材料和方法： 1．收集5例臨床根管治療失敗患牙的感染根管樣本，培養(yǎng)后采用全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定糞腸球菌，比濁法測(cè)定生長(zhǎng)曲線，與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29212的生長(zhǎng)曲線比較。 2．收集成人離體前牙12顆，截冠、保留牙根，完成根管預(yù)備。將每個(gè)牙

2、高溫高壓滅菌后固定在裝滿10ml BHI培養(yǎng)液的無(wú)菌玻璃瓶的膠塞上，牙根頂部高于瓶口2mm，對(duì)照組置無(wú)菌水培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行糞腸球菌培養(yǎng)，鑒定并以掃描電鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察。 結(jié)果： 1．1 例感染根管樣本分離到糞腸球菌，糞腸球菌生長(zhǎng)曲線可見(jiàn)遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及穩(wěn)定期3個(gè)階段，生長(zhǎng)期曲線角度較大，與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29212的生長(zhǎng)曲線相似。 2．實(shí)驗(yàn)組根管內(nèi)細(xì)菌

3、經(jīng)鑒定為糞腸球菌，6個(gè)根管樣本中可觀察到基質(zhì)包裹細(xì)菌形成柵欄樣結(jié)構(gòu)黏附在根管壁，多密集在根管下1/2段。 結(jié)論： 1．從根管治療失敗患牙的感染根管內(nèi)可分離到糞腸球菌。 2．感染根管樣本內(nèi)分離的糞腸球菌可在預(yù)備后的離體牙根管內(nèi)壁形成生物膜，生物膜多密集在根管下1/2段。 第二部分糞腸球菌生物膜結(jié)構(gòu)的體外觀察研究 目的： 建立體外糞腸球菌生物膜模型，觀察糞腸球菌生物膜的形成及其結(jié)構(gòu)。

4、材料和方法： 在玻片上形成4h、8h、12h、24h、48h糞腸球菌生物膜，各時(shí)段生物膜用L-7012 LIVE/DEAD Bacterial Viability Kit熒光染色后，采用激光共聚焦掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope，CLSM)觀察生物膜的斷層掃描圖像、生物膜的厚度并進(jìn)行三維重建，計(jì)算活菌百分比和死菌/活菌分布情況。ANOVE方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果：

5、糞腸球菌生物膜具有空間立體結(jié)構(gòu)，形態(tài)多樣，細(xì)菌密集，且分布不均勻，由死細(xì)菌和活細(xì)菌組成，還有豐富的基質(zhì)和管道系統(tǒng)。24h時(shí)平均厚度最大，在48h內(nèi)各時(shí)段生物膜中的活菌百分比由內(nèi)向外逐漸增加。 結(jié)論： 糞腸球菌生物膜有一定厚度，能形成三維立體空間結(jié)構(gòu)，具有多樣、不均質(zhì)、開(kāi)放的特點(diǎn)。24h時(shí)平均厚度最大，在48h內(nèi)各時(shí)段生物膜中的活菌百分比由內(nèi)向外逐漸增加。 第三部分糞腸球菌生物膜對(duì)氫氧化鈣和洗必泰敏感性的研究研究

6、 目的： CLSM觀察24h糞腸球菌生物膜對(duì)10﹪氫氧化鈣溶液和2﹪洗必泰溶液的敏感性，評(píng)價(jià)兩種藥物去除糞腸球菌生物膜的效果。 材料和方法： 將體外形成的24h糞腸球菌生物膜用10﹪氫氧化鈣溶液和2﹪洗必泰溶液分別處理3 min、10min、30 min，然后進(jìn)行熒光染色，采用CLSM觀察藥物作用后生物膜的斷層掃描圖像并進(jìn)行三維重建，計(jì)算活菌百分比。ANOVE和SNK(Student-Newman-Keul

7、s)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 1．10﹪氫氧化鈣溶液和2﹪洗必泰溶液處理24h生物膜3 min可滅活外層細(xì)菌；作用10min，對(duì)中間層和內(nèi)層細(xì)菌的滅活明顯增強(qiáng)；30 min時(shí)，大部分細(xì)菌被滅活。 2．10﹪氫氧化鈣溶液和2﹪洗必泰溶液處理生物膜3 min、10 min、30 min后，生物膜各層活菌百分比與對(duì)照組相比，除氫氧化鈣作用3min其內(nèi)層和中間層差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其余各時(shí)段、各層間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。