表皮葡萄球菌臨床株生物膜形成的檢測與藥物對生物膜干預作用的實驗研究.pdf

1、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，SE）是人類皮膚上廣泛存在的共生菌群，通常認為不致病。隨著醫(yī)用生物材料的應用日益廣泛，表皮葡萄球菌（簡稱表葡菌）已成為院內感染的重要條件病原菌。表葡菌的致病性在于能黏附于生物材料及機體粘膜組織表面形成生物膜（biofilm），生物膜可以保護內部細菌逃避抗菌藥物及宿主免疫殺傷，而且生物膜持續(xù)釋放細菌進入血流引起感染的慢性及反復發(fā)作，從而使感染難以清除，最終需要移除感染的植

2、入物。因此，生物膜相關感染嚴重影響和限制了醫(yī)學生物材料在臨床上的應用，已成為臨床亟待解決的棘手難題。 研究目的： 1．了解表皮葡萄球菌醫(yī)院內感染中MRSE的檢出率，將頭孢西丁紙片法與mecA基因PCR擴增結果比較，為臨床治療合理用藥提供幫助。 2．了解表皮葡萄球菌臨床株形成生物膜的能力、分析其生物膜形成能力與icaA基因的關系、探討形成生物膜的分子遺傳學基礎。 3．了解表葡菌臨床株生物膜相關基因icaA的

3、mRNA表達情況；探討icaA基因表達水平與生物膜形成能力的關系。 4．探索對生物膜細菌有干預作用的藥物聯(lián)合方案，為臨床解決生物膜相關感染的難題提供新思路。 研究方法： 1．收集2006年1月至2008年8月天津市四家醫(yī)院院內感染患者標本分離的表皮葡萄球菌臨床株進行常規(guī)、生化等鑒定，可疑菌株經API Staph紙條鑒定。 2．采用頭孢西丁紙片擴散法及mecA基因PCR擴增方法檢測MRSE。 3．C

4、RA實驗及粘附實驗檢測表葡菌生物膜的形成能力，生物膜相關基因icaA的PCR擴增；光學顯微鏡及掃描電鏡下觀察細菌生物膜的微觀形態(tài)。 4．icaA基因DNA序列測定，與GenBank已公布的表葡菌icaA序列同源性分析。 5．RT-PCR檢測icaA的mRNA轉錄水平，分析基因表達與生物膜形成的關系。 6．建立硅膠膜上的生物膜模型，采用棋盤法將萬古霉素分別與生物膜相關藥物（紅霉素、賴氨匹林、氨溴索）聯(lián)合作用于生物膜

5、，采用MTT法和平板計數(shù)法測定藥物作用后生物膜的菌落密度，并比較兩種檢測方法的結果。 研究結果： 1．205株表葡菌臨床株經mecA基因檢測出MRSE187株，檢出率為91．2%，頭孢西丁紙片擴散法檢出苯唑西林耐藥183株，耐藥率89．3%，兩種測方法具有統(tǒng)計學相關性（X2=46．437，P<0．05），兩種方法的一致率為91．2%。 2．205株表葡菌中CRA實驗陽性率11．7%，粘附試驗陽性率11．2%，ic

6、aA基因陽率13．7%，3種檢測方法均陽性9．3%，3種檢測方法間具有統(tǒng)計學相關性（P<0．05）。 3．掃描電鏡下微觀形態(tài)：生物膜陽性的表葡菌株可見葡萄球菌聚集成的微菌落，細胞間有胞外粘性基質包繞成團簇狀，生物膜陰性菌株未見微菌落形成。 4．表葡菌的icaA基因DNA序列分析：與GenBank已公布的表葡菌ATCC35984（RP62A）同源率97%～100%，均編碼N-乙酰葡聚糖轉移酶。 5．icaA基因（+

7、）而生物膜表型不同的6株菌RT-PCR檢測顯示，生物膜陽性菌株的icaA基因轉錄水平高于生物膜陰性菌株。 6．將萬古霉素分別與紅霉素、氨溴索或賴氨匹林聯(lián)合作用于表葡菌生物膜后，MTT法及平板計數(shù)法測定結果均顯示，藥物聯(lián)合作用比萬古霉素單獨作用時生物膜的菌落密度明顯減少，而且減少程度與藥物呈現(xiàn)濃度依賴性。 研究結論： 1．表葡菌臨床株中MRSE檢出率很高，臨床宜根據(jù)藥敏結果慎重及合理選用抗菌藥物。頭孢西丁紙片法可作

8、為實驗室常規(guī)篩檢MRSE的方法。 2．表葡菌臨床株icaA基因陽性率為13．7%，具有一定的形成生物膜的能力；icaA為表葡菌生物膜形成的遺傳基礎。 3．icaA基因PCR擴增與CRA實驗及粘附試驗間具有統(tǒng)計學的相關性與一致性。表型檢測操作簡便、快捷、便于批量測定，可推薦作為實驗室常規(guī)篩檢表葡菌生物膜形成能力的方法，便于向臨床及時提供相關信息。 4．icaA基因的表達水平與生物膜形成能力可能有關，有待進一步研究證