表皮葡萄球菌臨床株生物膜形成的檢測(cè)與藥物對(duì)生物膜干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis，SE）是人類皮膚上廣泛存在的共生菌群，通常認(rèn)為不致病。隨著醫(yī)用生物材料的應(yīng)用日益廣泛，表皮葡萄球菌（簡(jiǎn)稱表葡菌）已成為院內(nèi)感染的重要條件病原菌。表葡菌的致病性在于能黏附于生物材料及機(jī)體粘膜組織表面形成生物膜（biofilm），生物膜可以保護(hù)內(nèi)部細(xì)菌逃避抗菌藥物及宿主免疫殺傷，而且生物膜持續(xù)釋放細(xì)菌進(jìn)入血流引起感染的慢性及反復(fù)發(fā)作，從而使感染難以清除，最終需要移除感染的植

2、入物。因此，生物膜相關(guān)感染嚴(yán)重影響和限制了醫(yī)學(xué)生物材料在臨床上的應(yīng)用，已成為臨床亟待解決的棘手難題。 研究目的： 1．了解表皮葡萄球菌醫(yī)院內(nèi)感染中MRSE的檢出率，將頭孢西丁紙片法與mecA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果比較，為臨床治療合理用藥提供幫助。 2．了解表皮葡萄球菌臨床株形成生物膜的能力、分析其生物膜形成能力與icaA基因的關(guān)系、探討形成生物膜的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)。 3．了解表葡菌臨床株生物膜相關(guān)基因icaA的

3、mRNA表達(dá)情況；探討icaA基因表達(dá)水平與生物膜形成能力的關(guān)系。 4．探索對(duì)生物膜細(xì)菌有干預(yù)作用的藥物聯(lián)合方案，為臨床解決生物膜相關(guān)感染的難題提供新思路。 研究方法： 1．收集2006年1月至2008年8月天津市四家醫(yī)院院內(nèi)感染患者標(biāo)本分離的表皮葡萄球菌臨床株進(jìn)行常規(guī)、生化等鑒定，可疑菌株經(jīng)API Staph紙條鑒定。 2．采用頭孢西丁紙片擴(kuò)散法及mecA基因PCR擴(kuò)增方法檢測(cè)MRSE。 3．C

4、RA實(shí)驗(yàn)及粘附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表葡菌生物膜的形成能力，生物膜相關(guān)基因icaA的PCR擴(kuò)增；光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡下觀察細(xì)菌生物膜的微觀形態(tài)。 4．icaA基因DNA序列測(cè)定，與GenBank已公布的表葡菌icaA序列同源性分析。 5．RT-PCR檢測(cè)icaA的mRNA轉(zhuǎn)錄水平，分析基因表達(dá)與生物膜形成的關(guān)系。 6．建立硅膠膜上的生物膜模型，采用棋盤(pán)法將萬(wàn)古霉素分別與生物膜相關(guān)藥物（紅霉素、賴氨匹林、氨溴索）聯(lián)合作用于生物膜

5、，采用MTT法和平板計(jì)數(shù)法測(cè)定藥物作用后生物膜的菌落密度，并比較兩種檢測(cè)方法的結(jié)果。 研究結(jié)果： 1．205株表葡菌臨床株經(jīng)mecA基因檢測(cè)出MRSE187株，檢出率為91．2%，頭孢西丁紙片擴(kuò)散法檢出苯唑西林耐藥183株，耐藥率89．3%，兩種測(cè)方法具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（X2=46．437，P<0．05），兩種方法的一致率為91．2%。 2．205株表葡菌中CRA實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性率11．7%，粘附試驗(yàn)陽(yáng)性率11．2%，ic

6、aA基因陽(yáng)率13．7%，3種檢測(cè)方法均陽(yáng)性9．3%，3種檢測(cè)方法間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性（P<0．05）。 3．掃描電鏡下微觀形態(tài)：生物膜陽(yáng)性的表葡菌株可見(jiàn)葡萄球菌聚集成的微菌落，細(xì)胞間有胞外粘性基質(zhì)包繞成團(tuán)簇狀，生物膜陰性菌株未見(jiàn)微菌落形成。 4．表葡菌的icaA基因DNA序列分析：與GenBank已公布的表葡菌ATCC35984（RP62A）同源率97%～100%，均編碼N-乙酰葡聚糖轉(zhuǎn)移酶。 5．icaA基因（+

7、）而生物膜表型不同的6株菌RT-PCR檢測(cè)顯示，生物膜陽(yáng)性菌株的icaA基因轉(zhuǎn)錄水平高于生物膜陰性菌株。 6．將萬(wàn)古霉素分別與紅霉素、氨溴索或賴氨匹林聯(lián)合作用于表葡菌生物膜后，MTT法及平板計(jì)數(shù)法測(cè)定結(jié)果均顯示，藥物聯(lián)合作用比萬(wàn)古霉素單獨(dú)作用時(shí)生物膜的菌落密度明顯減少，而且減少程度與藥物呈現(xiàn)濃度依賴性。 研究結(jié)論： 1．表葡菌臨床株中MRSE檢出率很高，臨床宜根據(jù)藥敏結(jié)果慎重及合理選用抗菌藥物。頭孢西丁紙片法可作

8、為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)篩檢MRSE的方法。 2．表葡菌臨床株icaA基因陽(yáng)性率為13．7%，具有一定的形成生物膜的能力；icaA為表葡菌生物膜形成的遺傳基礎(chǔ)。 3．icaA基因PCR擴(kuò)增與CRA實(shí)驗(yàn)及粘附試驗(yàn)間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的相關(guān)性與一致性。表型檢測(cè)操作簡(jiǎn)便、快捷、便于批量測(cè)定，可推薦作為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)篩檢表葡菌生物膜形成能力的方法，便于向臨床及時(shí)提供相關(guān)信息。 4．icaA基因的表達(dá)水平與生物膜形成能力可能有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證