自發(fā)性高血壓大鼠腎臟組織蛋白質(zhì)表達譜的研究及氯沙坦對其的影響.pdf

1、高血壓病是一種常見病、多發(fā)病，嚴重危害著人類的健康。據(jù)估計世界范圍內(nèi)約有25％的成人患有此病，我國目前大約有1億多高血壓患者，而且高血壓的發(fā)病率還在逐年增加之中。大量流行病學和臨床實驗都已證明高血壓是大多數(shù)心血管疾病、腎臟疾病和周圍血管疾病的重要致病原因。高血壓已成為全球共同面臨的主要公共健康問題之一。腎臟既是體內(nèi)調(diào)節(jié)血壓的重要器官，同時又是高血壓損害的主要靶器官之一。腎功能的受損將進一步惡化高血壓的發(fā)展。近年來研究認為腎素一血管緊張素

2、一醛固酮系統(tǒng)(RAS)的激活可能在高血壓性腎損害中起著重要的作用。血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)是RAS中重要的活性物質(zhì)，可以刺激多種蛋白質(zhì)分子(轉(zhuǎn)化生長因子，骨橋蛋白等)的表達增加，進而引起腎臟的損害。氯沙坦是臨床上廣泛應用的一種Ang Ⅱ受體拮抗劑，其降壓，保護腎臟的作用已為大量臨床試驗所證實，然而其腎臟保護作用的確切機制仍未明了。 盡管人類基因組計劃已經(jīng)完成，然而依靠基因水平的分析有時并不足以了解疾病發(fā)生的機制，大部分疾病的發(fā)

3、生與蛋白質(zhì)的表達有關(guān)。對基因表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)的研究才是揭示生命活動和疾病機制的最終階段，由此在基因組學的基礎(chǔ)上產(chǎn)生了蛋白質(zhì)組學這門新興學科。蛋白質(zhì)組是指一個細胞或一個組織基因組所表達的全部蛋白質(zhì)，而蛋白質(zhì)組學則是應用各種技術(shù)手段來研究蛋白質(zhì)組的一門學科。其 目的 是從整體的角度分析細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成分、表達水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細胞生命活動規(guī)律。雙向凝膠電泳以及質(zhì)譜分析是蛋

4、白質(zhì)組研究中的主要技術(shù)，可同時分離成百上千種蛋白質(zhì)并進行鑒定。盡管蛋白質(zhì)組學的提出迄今不過十來年時間，卻發(fā)展迅速，己廣泛深入到生物醫(yī)學的各個領(lǐng)域，在發(fā)現(xiàn)疾病的標志分子，闡明疾病的分子機制，研究藥物新靶點等方面有著廣泛的應用。通過比較正常、高血壓時以及抗高血壓藥物治療后腎臟組織蛋白質(zhì)在表達數(shù)量、表達位置和修飾狀態(tài)上的差異，有可能發(fā)現(xiàn)與高血壓性腎臟損害相關(guān)的特異蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)既可為高血壓性腎損傷的發(fā)病機制提供線索，也可作為疾病診斷的分子

5、標志，還可作為治療和藥物開發(fā)的靶標，具有重要的理論和實際意義。 本實驗以自發(fā)性高血壓大鼠為研究對象，選取雄性6周齡的Wistar Kyoto大鼠6只和同周齡的自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)12只，SHR又隨機分為高血壓組及高血壓藥物干預組(Losartan組)。降壓藥物氯沙坦溶于水中，按每只大鼠20mg／kg／day的劑量喂給，根據(jù)大鼠體重，每周調(diào)整藥物劑量一次。每周測量大鼠血壓、體重。8周后處死大鼠取腎臟組織，提取組織蛋白。另取部

6、分腎組織HE染色，用于觀察腎組織病理形態(tài)學變化。蛋白濃度采用Bradford法測定。取蛋白樣品200μg進行雙向凝膠電泳，凝膠用硝酸銀進行染色，銀染的凝膠掃描后用Imagemaster 2D v5.0軟件進行分析，將分析發(fā)現(xiàn)的差異蛋白點切下，酶解消化，取消化后的多肽混合物進行質(zhì)譜鑒定，將所得的肽質(zhì)量指紋圖譜輸入到Mascot軟件中搜索NCBInr蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫以確定蛋白質(zhì)的歸屬。并對鑒定出的蛋白質(zhì)用western blot方法進行證實。

7、 結(jié)果： (1)6周時，與WKY相比，SHR大鼠的血壓已明顯升高(150.72±5.07 VS 110.11±3.74，p＜0.01)，隨著周齡的增加，SHR大鼠的血壓也隨之增加，而WKY大鼠血壓無明顯變化。給予氯沙坦治療兩周后，SHR大鼠血壓已明顯降低(162.33±8.86 vS 142.22±13.40，p＜0.05)，連續(xù)應用8周，降壓作用明顯而穩(wěn)定。 (2)14周齡時，SHR大鼠腎小動脈已可見病理上的改變

8、，動脈血管管壁增厚，管腔變窄；給予氯沙坦治療8周后，腎小動脈血管管壁增厚的程度有所減輕。 (3)對蛋白樣品進行雙向凝膠電泳，染色，成功建立了正常、高血壓及氯沙坦干預后大鼠腎臟組織的蛋白質(zhì)表達譜。三組凝膠檢測到的蛋白點數(shù)分別為1144±35、1215±78、1219±44。與WKY組相比較，SHR組腎臟表達有差異的蛋白有25個，其中表達增強的蛋白點有9個(2，3，5，6，13，14，15，17和22號點)，表達降低的蛋白點有6個(

9、16，18，20，23，24和25號點)，新出現(xiàn)的蛋白點有10個(1，4，7，8，9，10，11，12，19和21號點)。將這些點切下后進行質(zhì)譜鑒定，11個點得到了鑒定。與WKY相比，SHR大鼠腎臟蛋白表達上調(diào)的點有5個:laminin gamma 2 chain precursor(spot 2，22)，Tcrb protein(spot 5)，Aldo-keto reductase family 1 member A l(spot

10、6)和ribosomal protein S2(spot 12)；表達降低的點有2個：Hypothetical protein LOC361596(spot 18)and R／KEN cDNA 2700081015(spot 24)；新出現(xiàn)的點有4個：BC030314 protein(spot 1)，eno 1 protein(spot 4)，laminin gamma 2 chain precursor(spot 8)and phos

11、phatidylinositol transfer protein beta(spot 19)。使用氯沙坦治療后，SHR大鼠腎臟6個蛋白點表達降低：分別是BC030314 protein(spot 1)，enol protein(spot 4)，Aldo-keto reductase family 1(spot 6)，laminin gamma 2 chain precursor(spot 8)and phosphatidylinosi

12、tol transfer protein beta(spot 1 9)，laminin gamma 2 chain precursor(spot 19)；Hypothetical protein LOC361596(spot 18)和R／KEN cDNA 2700081015(spot 24)表達增加；另3個點laminin gamma 2 chain precursor(spot 2)，Tcrb protein(spot 5)和rib

13、osomal protein S2(spot 12)的表達無明顯改變。 (4)spot 2，8和22點被鑒定為同一個蛋白laminin gamma 2 chain precursor。 (5)銀染法進行質(zhì)譜鑒定的成功率為44％。 (6)采用Western blot方法對4號點(Enol protein)及18號點(Hypothetical protein LOC361596，也即是NADP+-ICDH)的檢測表明

14、：Enol protein在SHR大鼠腎臟中表達明顯升高，氯沙坦治療后該蛋白表達明顯降低；NADP+-ICDH在高血壓組表達明顯降低，藥物干預后表達增加，與雙向電泳結(jié)果相一致。 結(jié)論： (1)6周齡時SHR大鼠的血壓已明顯升高，隨著周齡的增加，SHR大鼠的血壓也隨之增加，14周齡時SHR大鼠腎小動脈已可見病理上的改變，SHR大鼠可用于高血壓腎臟損害的研究。 (2)氯沙坦治療兩周后，SHR大鼠血壓已明顯降低，持續(xù)給

15、藥，降壓作用明顯而穩(wěn)定。 (3)與WKY大鼠相比，高血壓大鼠腎臟組織中有25個蛋白質(zhì)的表達發(fā)生了明顯的改變。其中有11個蛋白點得到了鑒定，部分蛋白點的表達能被氯沙坦逆轉(zhuǎn)。這些蛋白質(zhì)涉及到能量代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運、細胞增生等過程，這些蛋白質(zhì)可作為進一步研究高血壓性腎損害的靶點。 (4)膠上不同位置的點被鑒定為同一個蛋白，可能與該蛋白存在異構(gòu)體或在實驗過程中被降解有關(guān)。 (5)銀染法用于質(zhì)譜鑒定的成功率較低，更為靈敏而有效