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文檔簡介
1、近年來,隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展,人們對骨折愈合的認(rèn)識已從細(xì)胞生物學(xué)向分子生物學(xué)水平深化。迄今為止,已在骨折部位發(fā)現(xiàn)諸多促進骨折愈合的物質(zhì),其中包括各種生長因子(Growthfactors),如成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblastgrowthfactors,F(xiàn)GFs)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforminggrowthfactor-β,TGF-β)、血小板衍生生長因子(Platelet-derivedgrowthfactor,PD
2、GF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bonemorphogeneticproteins,BMPs)等[1]。雖然生長因子在骨組織及血漿中含量甚微,但在骨折愈合過程中的調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、基質(zhì)合成與組織分化中起著重要的作用。因此,生長因子在骨折愈合過程中的作用研究已日益受到重視,尤其是對血小板衍生生長因子(Platelet-derivedGrowthFactor,PDGF)、護骨素(Osteoprotegerin,OPG)、破骨細(xì)胞活化因子(Recepto
3、rActivatorofNF-KBLigand,RANKL)以及它們之間的相互作用關(guān)系研究,具有重要的意義[2]。現(xiàn)已證明,PDGF可刺激骨膜成纖維細(xì)胞、骨祖細(xì)胞及成骨細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞的有絲分裂。PDGF不僅可促進細(xì)胞的增殖和分化,還能促進成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞合成骨基質(zhì)、膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì),同時也可導(dǎo)致膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積,從而促進骨折愈合[3]。研究證實OPG在維持骨穩(wěn)定中起決定作用,它能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和活動[4]。通過
4、建立OPG轉(zhuǎn)基因動物模型,發(fā)現(xiàn)OPG對骨折愈合的作用發(fā)生在骨折局部。在骨折愈合過程中,成骨細(xì)胞產(chǎn)生的RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK受體結(jié)合發(fā)揮功能,使破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化成具有功能活性的破骨細(xì)胞;另一方面,成骨細(xì)胞分泌的OPG作為RANKL的餌受體,競爭性地結(jié)合RANKL,抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能,從而達到骨折愈合和骨折塑形的動態(tài)平衡[5]。研究PDGF、OPG和RANKL在下頜骨骨折愈合過程中的相互作用關(guān)系是促進下頜骨骨折
5、愈合研究重要線索之一。目前已知PDGF對骨折愈合有促進作用,OPG可促進成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì),RANKL可激活破骨細(xì)胞的骨吸收作用。但在動物體內(nèi),OPG和RANKL的表達與骨折愈合進程的關(guān)系,以及PDGF與OPG的相互作用關(guān)系報道較少。[6]。 目的:通過動物實驗,研究OPG、RANKL在骨折愈合不同階段的表達,分析OPG、RANKL的表達與骨折愈合進程的關(guān)系。通過建立成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)系,研究PDGF抗體對體外誘導(dǎo)培養(yǎng)成骨細(xì)胞的功
6、能影響,探討PDGF對OPG、RANKL的作用機制及骨折愈合中的信號傳導(dǎo)途徑。 方法:1.建立下頜骨骨折動物模型,在不同時間點觀察下頜骨骨折愈合情況,以及骨折愈合進程與OPG、RANKL表達的關(guān)系。選用成年中國大白兔30只,分實驗組和對照組,分別用手術(shù)的方法制作下頜骨骨折模型,術(shù)后于不同的時間點取骨痂標(biāo)本。7~14d的標(biāo)本進行電鏡檢查,7~56d的標(biāo)本用10%EDTA脫鈣后切片,分別進行HE染色,及兔抗OPG、RANKL為一抗的
7、免疫組化染色,觀察骨折愈合情況和OPG、RANKL表達與骨折愈合的關(guān)系。染色的切片照相后,用Image-Pro-Plus4.5圖像分析系統(tǒng)分析,SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析。 2.體外原代分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞,PDGF抗體誘導(dǎo)培養(yǎng)成骨細(xì)胞,觀察成骨細(xì)胞的生長、分化、礦化、OPG免疫組化表達及OPG基因在成骨細(xì)胞中的表達。取出生7d內(nèi)中國大白兔幼兔10只,于無菌狀態(tài)下切取其顱骨,切成1mm3的小塊,用1640培養(yǎng)基并加入10%小牛
8、血清進行培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞用差數(shù)貼壁法進行分離純化,ALP進行染色鑒定,礦化成骨的方法驗證。培養(yǎng)的成骨細(xì)胞分實驗組和對照組,實驗組用PDGF抗體誘導(dǎo)培養(yǎng),對照組用0.01M的PBS誘導(dǎo)培養(yǎng),然后分別檢測兩組細(xì)胞的OPG免疫組化表達和OPGmRNA表達。染色的切片照相后,用Image-Pro-Plus4.5圖像分析系統(tǒng)進行分析,SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果:1.本實驗建立的下頜骨骨折模型,術(shù)后骨折區(qū)HE染色發(fā)現(xiàn):術(shù)后7d
9、,骨痂成分以肉芽組織為主,由大量成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管,少量成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞組成;術(shù)后14~56d,骨痂中成骨細(xì)胞逐漸增多,骨質(zhì)形成增多。在顯微鏡下大致可見骨折愈合過程分血腫形成、血腫機化、骨痂形成期、骨折愈合期、骨功能性改建期,符合骨折愈合的一般規(guī)律。 2.本實驗培養(yǎng)的細(xì)胞,通過鏡下觀察發(fā)現(xiàn)與文獻報道的成骨細(xì)胞具有相同的形態(tài)特征和生長特點,ALP染色陽性,Giemsa染色陽性,并能體外鈣化,符合成骨細(xì)胞的一般特點。 3
10、.骨保護素在骨痂組織及骨痂周圍組織中均有表達。骨折后14~28d成骨細(xì)胞上OPG表達逐步增強,至28d表達達到最強,然后逐漸減弱;破骨細(xì)胞及骨痂周圍組織始終為弱陽性表達。對照組成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞表達呈弱陽性表達,實驗組成骨細(xì)胞與對照組及實驗組其它細(xì)胞表達比較均有顯著差異。RANKL在下頜骨骨折28d于破骨細(xì)胞上強陽性表達,至56d時表達達到最強。實驗組破骨細(xì)胞的RANKL表達與對照組破骨細(xì)胞及實驗組其它細(xì)胞相比有顯著差異。破骨細(xì)胞的RN
11、AKL表達主要發(fā)生在骨折愈合后期,與成骨細(xì)胞相比兩者差異具有顯著性。 4.在體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞體系中,PDGF抗體可抑制成骨細(xì)胞的分化、成熟、礦化及OPG的免疫組化及mRNA基因表達,與對照組相比有顯著差異。通過OPG免疫組化染色發(fā)現(xiàn),PDGF抗體可抑制成骨細(xì)胞的免疫組化表達;通過成骨細(xì)胞OPGmRNA基因表達研究發(fā)現(xiàn),在PDGF抗體的作用下實驗組表達減弱。 結(jié)論:1.本實驗建立的下頜骨骨折模型,其愈合過程的組織學(xué)變化符
12、合下頜骨骨折正常愈合規(guī)律,可以用于下頜骨骨折愈合的相關(guān)實驗研究。 2.本實驗培養(yǎng)的細(xì)胞具有較強的ALP活性,Giemsa染色陽性,并能體外鈣化,具有與文獻報道的成骨細(xì)胞相同的形態(tài)特征及生長特點,表明分離培養(yǎng)出的細(xì)胞為成骨細(xì)胞,可以用于成骨細(xì)胞相關(guān)實驗的研究。 3.在下頜骨骨折的愈合過程的早期以成骨細(xì)胞上的OPG的表達為主,骨折愈合的后期以RANKL在破骨細(xì)胞上強陽性表達為主,提示OPG在骨折愈合過程中主要作用是促進成骨細(xì)
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