PDGF、OPG和RANKL在下頜骨骨折愈合過程中的表達.pdf

1、近年來，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，人們對骨折愈合的認(rèn)識已從細(xì)胞生物學(xué)向分子生物學(xué)水平深化。迄今為止，已在骨折部位發(fā)現(xiàn)諸多促進骨折愈合的物質(zhì)，其中包括各種生長因子(Growthfactors)，如成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblastgrowthfactors，F(xiàn)GFs)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforminggrowthfactor-β，TGF-β)、血小板衍生生長因子(Platelet-derivedgrowthfactor，PD

2、GF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bonemorphogeneticproteins,BMPs)等[1]。雖然生長因子在骨組織及血漿中含量甚微，但在骨折愈合過程中的調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂、基質(zhì)合成與組織分化中起著重要的作用。因此，生長因子在骨折愈合過程中的作用研究已日益受到重視，尤其是對血小板衍生生長因子(Platelet-derivedGrowthFactor,PDGF)、護骨素(Osteoprotegerin,OPG)、破骨細(xì)胞活化因子(Recepto

3、rActivatorofNF-KBLigand,RANKL)以及它們之間的相互作用關(guān)系研究，具有重要的意義[2]。現(xiàn)已證明，PDGF可刺激骨膜成纖維細(xì)胞、骨祖細(xì)胞及成骨細(xì)胞的DNA合成和細(xì)胞的有絲分裂。PDGF不僅可促進細(xì)胞的增殖和分化，還能促進成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞合成骨基質(zhì)、膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，同時也可導(dǎo)致膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，從而促進骨折愈合[3]。研究證實OPG在維持骨穩(wěn)定中起決定作用，它能調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的增殖和活動[4]。通過

4、建立OPG轉(zhuǎn)基因動物模型，發(fā)現(xiàn)OPG對骨折愈合的作用發(fā)生在骨折局部。在骨折愈合過程中，成骨細(xì)胞產(chǎn)生的RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面的RANK受體結(jié)合發(fā)揮功能，使破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化成具有功能活性的破骨細(xì)胞；另一方面，成骨細(xì)胞分泌的OPG作為RANKL的餌受體，競爭性地結(jié)合RANKL，抑制破骨細(xì)胞的骨吸收功能，從而達到骨折愈合和骨折塑形的動態(tài)平衡[5]。研究PDGF、OPG和RANKL在下頜骨骨折愈合過程中的相互作用關(guān)系是促進下頜骨骨折

5、愈合研究重要線索之一。目前已知PDGF對骨折愈合有促進作用，OPG可促進成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì)，RANKL可激活破骨細(xì)胞的骨吸收作用。但在動物體內(nèi)，OPG和RANKL的表達與骨折愈合進程的關(guān)系，以及PDGF與OPG的相互作用關(guān)系報道較少。[6]。 目的：通過動物實驗，研究OPG、RANKL在骨折愈合不同階段的表達，分析OPG、RANKL的表達與骨折愈合進程的關(guān)系。通過建立成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)系，研究PDGF抗體對體外誘導(dǎo)培養(yǎng)成骨細(xì)胞的功

6、能影響，探討PDGF對OPG、RANKL的作用機制及骨折愈合中的信號傳導(dǎo)途徑。 方法：1.建立下頜骨骨折動物模型，在不同時間點觀察下頜骨骨折愈合情況，以及骨折愈合進程與OPG、RANKL表達的關(guān)系。選用成年中國大白兔30只，分實驗組和對照組，分別用手術(shù)的方法制作下頜骨骨折模型，術(shù)后于不同的時間點取骨痂標(biāo)本。7～14d的標(biāo)本進行電鏡檢查，7～56d的標(biāo)本用10％EDTA脫鈣后切片，分別進行HE染色，及兔抗OPG、RANKL為一抗的

7、免疫組化染色，觀察骨折愈合情況和OPG、RANKL表達與骨折愈合的關(guān)系。染色的切片照相后，用Image-Pro-Plus4.5圖像分析系統(tǒng)分析，SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析。 2.體外原代分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞，PDGF抗體誘導(dǎo)培養(yǎng)成骨細(xì)胞，觀察成骨細(xì)胞的生長、分化、礦化、OPG免疫組化表達及OPG基因在成骨細(xì)胞中的表達。取出生7d內(nèi)中國大白兔幼兔10只，于無菌狀態(tài)下切取其顱骨，切成1mm3的小塊，用1640培養(yǎng)基并加入10％小牛

8、血清進行培養(yǎng)。培養(yǎng)的細(xì)胞用差數(shù)貼壁法進行分離純化，ALP進行染色鑒定，礦化成骨的方法驗證。培養(yǎng)的成骨細(xì)胞分實驗組和對照組，實驗組用PDGF抗體誘導(dǎo)培養(yǎng)，對照組用0.01M的PBS誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后分別檢測兩組細(xì)胞的OPG免疫組化表達和OPGmRNA表達。染色的切片照相后，用Image-Pro-Plus4.5圖像分析系統(tǒng)進行分析，SPSS10.0軟件進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果：1.本實驗建立的下頜骨骨折模型，術(shù)后骨折區(qū)HE染色發(fā)現(xiàn)：術(shù)后7d

9、，骨痂成分以肉芽組織為主，由大量成纖維細(xì)胞、毛細(xì)血管，少量成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞組成；術(shù)后14～56d，骨痂中成骨細(xì)胞逐漸增多，骨質(zhì)形成增多。在顯微鏡下大致可見骨折愈合過程分血腫形成、血腫機化、骨痂形成期、骨折愈合期、骨功能性改建期，符合骨折愈合的一般規(guī)律。 2.本實驗培養(yǎng)的細(xì)胞，通過鏡下觀察發(fā)現(xiàn)與文獻報道的成骨細(xì)胞具有相同的形態(tài)特征和生長特點，ALP染色陽性，Giemsa染色陽性，并能體外鈣化，符合成骨細(xì)胞的一般特點。 3

10、.骨保護素在骨痂組織及骨痂周圍組織中均有表達。骨折后14～28d成骨細(xì)胞上OPG表達逐步增強，至28d表達達到最強，然后逐漸減弱；破骨細(xì)胞及骨痂周圍組織始終為弱陽性表達。對照組成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞表達呈弱陽性表達，實驗組成骨細(xì)胞與對照組及實驗組其它細(xì)胞表達比較均有顯著差異。RANKL在下頜骨骨折28d于破骨細(xì)胞上強陽性表達，至56d時表達達到最強。實驗組破骨細(xì)胞的RANKL表達與對照組破骨細(xì)胞及實驗組其它細(xì)胞相比有顯著差異。破骨細(xì)胞的RN

11、AKL表達主要發(fā)生在骨折愈合后期，與成骨細(xì)胞相比兩者差異具有顯著性。 4.在體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞體系中，PDGF抗體可抑制成骨細(xì)胞的分化、成熟、礦化及OPG的免疫組化及mRNA基因表達，與對照組相比有顯著差異。通過OPG免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，PDGF抗體可抑制成骨細(xì)胞的免疫組化表達；通過成骨細(xì)胞OPGmRNA基因表達研究發(fā)現(xiàn)，在PDGF抗體的作用下實驗組表達減弱。 結(jié)論：1.本實驗建立的下頜骨骨折模型，其愈合過程的組織學(xué)變化符

12、合下頜骨骨折正常愈合規(guī)律，可以用于下頜骨骨折愈合的相關(guān)實驗研究。 2.本實驗培養(yǎng)的細(xì)胞具有較強的ALP活性，Giemsa染色陽性，并能體外鈣化，具有與文獻報道的成骨細(xì)胞相同的形態(tài)特征及生長特點，表明分離培養(yǎng)出的細(xì)胞為成骨細(xì)胞，可以用于成骨細(xì)胞相關(guān)實驗的研究。 3.在下頜骨骨折的愈合過程的早期以成骨細(xì)胞上的OPG的表達為主，骨折愈合的后期以RANKL在破骨細(xì)胞上強陽性表達為主，提示OPG在骨折愈合過程中主要作用是促進成骨細(xì)