羅非魚SDR超家族基因的生物信息學分析及其在性腺發(fā)育過程中的作用研究.pdf

1、短鏈脫氫還原酶（short-chain dehydrogenases/reductases。SDR）超家族包含了視黃醛脫氫酶、羥基類固醇脫氫酶、羰基還原酶、15羥基前列腺素脫氫酶、UDP-葡萄4-糖異構酶以及GDP甘露糖4,6-脫水酶等。SDR家族成員表達于各種組織、器官，參與個體生長、發(fā)育、生殖等各個生物學過程。根據隱馬爾可夫模型，在人類基因組中已經鑒定了47個SDR亞家族，76個SDR基因。在植物中，如擬南芥、大豆、葡萄等植物中鑒定

2、了49個SDR亞家族，對應著68-315個SDR基因，而在其他物種中還沒有進一步的報道。同時關于SDR超家族在生殖過程中的功能研究僅見于一些哺乳動物中，而魚類中幾乎未見報道。為了系統(tǒng)深入的研究 SDR超家族成員在魚類性腺發(fā)育及性別決定與分化過程中的潛在作用，我們從基因組水平以及轉錄組水平對尼羅羅非魚的SDR家族成員進行了系統(tǒng)分析，并對其部分家族成員在性腺發(fā)育中的可能作用進行了探討。
　　通過同源比對搜索以及轉錄組數據分析，本研究從

3、尼羅羅非魚基因組中共分離到119個SDR超家族成員。除此之外，我們還從人類，雞，非洲爪蟾，斑馬魚，青鳉，腔棘魚，象鯊，斑點雀鱔，紅鰭東方鲀中分別分離了76、77、82、121、99、85、75、82、68個SDR基因。羅非魚中119個SDR基因可以分為49個亞家族，并且通過序列特征可以將SDR基因分為4類，“經典”、“擴展”、“復雜”和“未賦值”SDR，其中大多數SDR基因屬于“經典”SDR，其次為“擴展”SDR。我們發(fā)現，大多數SDR

4、基因在魚類進行了多個旁系基因的復制，如rdh14。dhrs13。hsd17β12。tdh。rdh10和dhrs12這些基因存在3次復制基因；rdh12。cbr1。rdh8基因存在4個復制基因；hpgd基因存在5個復制。有趣的是，我們發(fā)現羅非魚SDR基因復制一般發(fā)生在同一條染色體，最為典型的是dhrs11基因，在羅非魚基因組中LG14上有12個串聯(lián)重復復制基因，通過系統(tǒng)進化和共線性分析發(fā)現，dhrs11在羅非魚中進行了多次串聯(lián)型復制。由于

5、魚類在進化上經歷了一次特有的基因組復制，由此我們推斷，SDR超家族在羅非魚中的擴張可能是由某些家族成員的串聯(lián)型復制以及魚類特有的基因組復制造成的。
　　對尼羅羅非魚8個成魚組織的轉錄組分析結果表明 bdh2。decr1。ndufa9。sccqdha。hsdl2。hsd17β10和qdpra基因屬于泛表達基因，即8個組織均有表達。dhrs7a。gale。blverb2高表達于頭腎;hsd3β2。hsd17β12b。rdh13,和kd

6、sr高表達于精巢；hsd3β7。hsd17β4。dhrs9a。rdh10b。rdh12a。dhrs7b。bdh1。decr2。hpgd1。spra。sdr39u高表達于卵巢,這些結果暗示上述基因在對應組織的重要作用。通過對孵化后5天、30天、90天、180天尼羅羅非魚雌、雄性腺共8個轉錄組數據進行分析，我們發(fā)現尼羅羅非魚119個SDR基因中有113個在性腺被檢測到。在5、30、90和180 dah性腺轉錄組中分別篩選到了25、3、47和

7、30個呈雌、雄性腺差異表達的SDR基因。用原位雜交（ISH）和real-time PCR驗證了dhrs11-5、hsd11β2和hsd17β3的表達，結果表明，dhrs11-5在5天時表達量最高，呈現明顯的雌雄性腺差異性表達，在雌魚中的表達遠遠高于雄魚。hsd11β2在5天時就開始在性腺中表達，6個月時表達量最高并且雄魚遠高于雌魚，ISH結果表明hsd11β2表達于6個月精巢的間質細胞；hsd17β3主要表達于頭腎，其結果和轉錄組分析結

8、果一致。
　　轉錄組數據和實驗室早期研究都一致表明，hsd3β1在5天時表現出雌性特異表達，并且表達量逐漸升高，在30d左右達到最高；同時在XY雄魚性腺中hsd3β1的表達從30d開始逐漸上升，到90d的時候開始下降，直到180d還維持較高的表達水平。hsd3β7在XX雌魚性腺中的表達從孵化后60天才開始急速上升，在雄魚中，hsd3β7的表達一直處于較低水平。并且 hsd3β基因是魚類性激素合成途徑的關鍵酶之一。通過CRISPR/

9、Cas9基因敲除技術對hsd3β1基因敲除后發(fā)現，對于雄魚，在4個月時，正常對照組中性腺存在精原細胞、精母細胞、精子細胞等各級生精細胞，而在hsd3β1基因敲除陽性魚的精巢中只能看見少數精原細胞，并且通過real-time PCR發(fā)現減數分裂相關基因顯著性下調，預示著hsd3β1的敲除導致了精子發(fā)生的延遲。Hsd3β1基因敲除后的雌魚的卵巢則部分性逆轉為精巢或者精卵巢，預示著hsd3β1可能通過性腺類固醇的生成參與羅非魚的性別決定和性腺

10、的生長，同時也進一步驗證了SDR家族基因可能對于魚類性別決定發(fā)揮重要作用。
　　綜上所述，我們在尼羅羅非魚基因組中分離到119個SDR基因，cbr、dhrs11等基因在羅非魚的基因組中發(fā)生了串聯(lián)型復制。對尼羅羅非魚8個成魚組織的轉錄組分析結果表明，有113個SDR基因在性腺表達，用ISH和real-time PCR驗證了dhrs11-5、hsd11β2和hsd17β3的表達，其結果和轉錄組一致。通過CRISPR/Cas9技術敲除h