SOCS1對干擾素γ在心肌細胞中抗柯薩奇病毒活性影響的實驗研究.pdf

1、第一部分SD大鼠乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)、CVB3感染心肌細胞模型的建立 目的：成功建立病毒性心肌炎病毒直接感染心肌細胞的體外模型，為進一步從心肌細胞分子生物學和病理學的角度，探討病毒性心肌炎病毒損傷階段的發(fā)病機理奠定基礎(chǔ)。 方法：以柯薩奇B3m病毒感染新生SD大鼠的培養(yǎng)心肌細胞，觀察感染后細胞病變、搏動情況、并用免疫組化法來確定心肌細胞的純度，采用RT-PCR方法擴增出CVB3的特異性條帶。 結(jié)果：培養(yǎng)的SD大鼠搏

2、動心肌細胞經(jīng)α-actin免疫組化染色后確定其純度達到95％以上，感染柯薩奇B3病毒后，逐步出現(xiàn)了細胞病變，細胞停止搏動，心肌細胞培養(yǎng)上清液中肌酸激酶(CK-MB)的含量明顯增高，RT-PCR并可以擴增出CVB3特異性條帶。 結(jié)論：柯薩奇病毒感染心肌細胞的體外模型可以作為體外研究病毒性心肌炎的基礎(chǔ)。 第二部分SOCS1基因和顯性突變體SOCS1基因綠色熒光表達載體的構(gòu)建及其在心肌細胞中的瞬時表達 目的：

3、構(gòu)建SOCS1基因和顯性失活突變體SOCS1(dnSOCS1)基因的綠色熒光表達載體，并在心肌細胞中進行表達 方法：現(xiàn)將pcDNA3.0-SOCS1和pcDNA3.0-dnSOCS1兩個基因分別用EcoRI和XhoI進行限制性雙酶切得到SOCS1和dnSOCS1兩目的基因；然后將pEGFP-C1用EcoRI和SalI進行雙酶切，得到載體片段，把兩個目的基因定向克隆到綠色熒光載體pEGFP-C1中，即構(gòu)建了SOCS1和dnSOCS

4、1兩基因的綠色熒光表達載體pEGFP-C1-SOCS1和pEGFP-C1-dnSOCS1。然后利用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)將兩基因分別轉(zhuǎn)染到原代心肌細胞。 結(jié)果：在原代心肌細胞中成功表達了綠色熒光真核表達載體pEGFP-C1-SOCS1和pEGFP-C1-dnSOCS1，48小時表達效率達25.20±6.25％。 結(jié)論：我們首先構(gòu)建了SOCS1和顯性失活突變SOCS1基因的綠色熒光表達載體pEGFP

5、-C1-SOCS1和pEGFP-C1-dnSOCS1，利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染至心肌細胞中并成功的進行了表達，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。 第三部分受病毒感染的心肌細胞中SOCS1降低IFNγ誘導(dǎo)的JAK-STAT信號通路敏感性及機制的初步研究 目的：在病毒性心肌炎細胞模型中，觀察JAK-STAT信號通路的特異性內(nèi)源抑制物SOCS1及其顯性失活突變體SOCS1(dnSOCS1)對IFN-γ抗CVB3活性的影響。本研究將探

6、索在病毒性心肌炎中SOCS1對IFN-γ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，并從IFNγ受體和干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)物合成的水平研究其效應(yīng)改變的機制。 方法：構(gòu)建pEGFP-C1-SOCS1及pEGFP-C1-dnSOCS1的真核表達載體，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至心肌細胞后，加用干擾素γ刺激細胞并感染病毒，采用熒光顯微鏡檢測心肌細胞中SOCS1和dnSOC1的表達，同時利用Westernblot法測定不同條件下STAT1,STAT3,JAK1的表達水平并測定病毒

7、滴度，采用RT-PCR方法測定干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)物2’，5’-寡腺苷酸合成酶(2,5-OAS)和干擾素γ受體(IFNGR1)mRNA水平。 結(jié)果：與轉(zhuǎn)染dnSOCS1組相比，在轉(zhuǎn)染SOCS1組病毒滴度高，而心肌細胞存活率低，心肌細胞搏動時間短，磷酸化STAT1，JAK1的表達很少。而在dnSOCS1組，磷酸化STAT1，JAK1的表達更明顯，心肌細胞存活率高，細胞病變少見，干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)物2,5-OAS的mRNA表達較高。在轉(zhuǎn)染SOCS