SOCS1對(duì)干擾素γ在心肌細(xì)胞中抗柯薩奇病毒活性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)、CVB3感染心肌細(xì)胞模型的建立 目的：成功建立病毒性心肌炎病毒直接感染心肌細(xì)胞的體外模型，為進(jìn)一步從心肌細(xì)胞分子生物學(xué)和病理學(xué)的角度，探討病毒性心肌炎病毒損傷階段的發(fā)病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 方法：以柯薩奇B3m病毒感染新生SD大鼠的培養(yǎng)心肌細(xì)胞，觀察感染后細(xì)胞病變、搏動(dòng)情況、并用免疫組化法來(lái)確定心肌細(xì)胞的純度，采用RT-PCR方法擴(kuò)增出CVB3的特異性條帶。 結(jié)果：培養(yǎng)的SD大鼠搏

2、動(dòng)心肌細(xì)胞經(jīng)α-actin免疫組化染色后確定其純度達(dá)到95％以上，感染柯薩奇B3病毒后，逐步出現(xiàn)了細(xì)胞病變，細(xì)胞停止搏動(dòng)，心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中肌酸激酶(CK-MB)的含量明顯增高，RT-PCR并可以擴(kuò)增出CVB3特異性條帶。 結(jié)論：柯薩奇病毒感染心肌細(xì)胞的體外模型可以作為體外研究病毒性心肌炎的基礎(chǔ)。 第二部分SOCS1基因和顯性突變體SOCS1基因綠色熒光表達(dá)載體的構(gòu)建及其在心肌細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá) 目的：

3、構(gòu)建SOCS1基因和顯性失活突變體SOCS1(dnSOCS1)基因的綠色熒光表達(dá)載體，并在心肌細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá) 方法：現(xiàn)將pcDNA3.0-SOCS1和pcDNA3.0-dnSOCS1兩個(gè)基因分別用EcoRI和XhoI進(jìn)行限制性雙酶切得到SOCS1和dnSOCS1兩目的基因；然后將pEGFP-C1用EcoRI和SalI進(jìn)行雙酶切，得到載體片段，把兩個(gè)目的基因定向克隆到綠色熒光載體pEGFP-C1中，即構(gòu)建了SOCS1和dnSOCS

4、1兩基因的綠色熒光表達(dá)載體pEGFP-C1-SOCS1和pEGFP-C1-dnSOCS1。然后利用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)將兩基因分別轉(zhuǎn)染到原代心肌細(xì)胞。 結(jié)果：在原代心肌細(xì)胞中成功表達(dá)了綠色熒光真核表達(dá)載體pEGFP-C1-SOCS1和pEGFP-C1-dnSOCS1，48小時(shí)表達(dá)效率達(dá)25.20±6.25％。 結(jié)論：我們首先構(gòu)建了SOCS1和顯性失活突變SOCS1基因的綠色熒光表達(dá)載體pEGFP

5、-C1-SOCS1和pEGFP-C1-dnSOCS1，利用脂質(zhì)體將其轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞中并成功的進(jìn)行了表達(dá)，為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。 第三部分受病毒感染的心肌細(xì)胞中SOCS1降低IFNγ誘導(dǎo)的JAK-STAT信號(hào)通路敏感性及機(jī)制的初步研究 目的：在病毒性心肌炎細(xì)胞模型中，觀察JAK-STAT信號(hào)通路的特異性內(nèi)源抑制物SOCS1及其顯性失活突變體SOCS1(dnSOCS1)對(duì)IFN-γ抗CVB3活性的影響。本研究將探

6、索在病毒性心肌炎中SOCS1對(duì)IFN-γ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，并從IFNγ受體和干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)物合成的水平研究其效應(yīng)改變的機(jī)制。 方法：構(gòu)建pEGFP-C1-SOCS1及pEGFP-C1-dnSOCS1的真核表達(dá)載體，以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞后，加用干擾素γ刺激細(xì)胞并感染病毒，采用熒光顯微鏡檢測(cè)心肌細(xì)胞中SOCS1和dnSOC1的表達(dá)，同時(shí)利用Westernblot法測(cè)定不同條件下STAT1,STAT3,JAK1的表達(dá)水平并測(cè)定病毒

7、滴度，采用RT-PCR方法測(cè)定干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)物2’，5’-寡腺苷酸合成酶(2,5-OAS)和干擾素γ受體(IFNGR1)mRNA水平。 結(jié)果：與轉(zhuǎn)染dnSOCS1組相比，在轉(zhuǎn)染SOCS1組病毒滴度高，而心肌細(xì)胞存活率低，心肌細(xì)胞搏動(dòng)時(shí)間短，磷酸化STAT1，JAK1的表達(dá)很少。而在dnSOCS1組，磷酸化STAT1，JAK1的表達(dá)更明顯，心肌細(xì)胞存活率高，細(xì)胞病變少見(jiàn)，干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)物2,5-OAS的mRNA表達(dá)較高。在轉(zhuǎn)染SOCS