柯薩奇病毒感染小鼠心肌細胞及心臟成纖維細胞后CD80與CD86的表達情況.pdf

1、目的：病毒性心肌炎（Viral myocarditis，VMC）是指由病毒感染引起的心肌疾病，其中最常見的原因是由柯薩奇病毒B3( Coxsackie virus B3， CVB3)感染。病毒感染以后引起心肌炎的發(fā)病機制尚未完全闡明，目前較多的研究認為是病毒直接損傷和感染后機體的免疫反應(yīng)引發(fā)的炎癥性損傷。病毒性心肌炎可發(fā)展為擴張性心肌病，兒童發(fā)病后致死致殘率較高，且到目前為止臨床仍然缺乏特效的治療方法。因此對于CVB3感染以后引起病毒性

2、心肌炎的發(fā)病過程以及治療方法的研究都非常有必要。心臟中除了最有功能的心肌細胞以外，還有50％的細胞為成纖維細胞。所以對心臟心肌細胞和成纖維細胞在CVB3刺激以后產(chǎn)生的反應(yīng)進行研究，可以為研究病毒性心肌炎的發(fā)病過程及找到有效的治療方法提供一定的依據(jù)。
　　方法：
　　1體外培養(yǎng)C57BL/6小鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞：無菌操作取新生C57BL/6小鼠心臟，取出后，放入不含有血清和抗生素的DMEM高糖培養(yǎng)基中。先除心臟以外的組

3、織，再使用吸管反復(fù)吹打進行沖洗，沖洗完的心臟中重新加入少量不含血清和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基。用無菌剪刀將其剪碎，依次用胰酶與Ⅱ型膠原酶消化后，用銅網(wǎng)過濾。將濾液收集到離心管中進行離心。去掉上清液后再離心一次，再次棄去上清液，加入含有血清和雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基。吹散后將細胞鋪入六孔板內(nèi)。90分鐘后，把孔內(nèi)未貼壁的細胞吸出移至新的六孔板中，向剩余孔內(nèi)再加入新鮮的含血清DMEM高糖培養(yǎng)基（采用1.5小時差速貼壁法分離培養(yǎng)小鼠心肌細胞與心

4、臟成纖維細胞）。最后將六孔板放入CO2培養(yǎng)箱內(nèi)37℃進行培養(yǎng)。
　　2培養(yǎng)經(jīng)柯薩奇病毒感染后的小鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞并且觀察細胞病變。
　　3細胞CD80和CD86的表達情況測定：Trizol法提取細胞總RNA，按照試劑說明提取感染柯薩奇病毒后不同時間點的心肌細胞總RNA和心臟成纖維細胞總RNA。本實驗中心肌細胞感染柯薩奇病毒后選擇的時間點分別為1天、3天、5天、7天、9天；心臟成纖維細胞感染柯薩奇病毒后選擇的時間點分

5、別為3小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時。未感染病毒的正常細胞作為對照組，進行Real Time PCR擴增，觀察細胞CD80和CD86的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1小鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞能夠進行體外培養(yǎng)并且生長狀況良好。
　　2觀察柯薩奇病毒感染后的細胞發(fā)現(xiàn)：小鼠心肌細胞中部分細胞出現(xiàn)了病變，而小鼠心臟成纖維細胞中只有少量細胞出現(xiàn)了病變。
　　3進行Real Time PCR后，結(jié)果顯

6、示:感染柯薩奇病毒以后，心肌細胞中CD80的mRNA的表達在第1天驟然下降，而后開始升高，在第3天達到高峰，接著又開始下降，第5天、第7天、第9天持續(xù)下降，整個過程均在正常水平以下；CD86的mRNA的表達同樣在第1天明顯下降，而后開始升高，在第3天達到高峰，接著開始下降，第5天、第7天、第9天持續(xù)下降，整個過程均在正常水平以下。Real Time PCR的結(jié)果也顯示，在被柯薩奇病毒感染以后，心臟成纖維細胞中CD80的mRNA的表達在3

7、小時、6小時、12小時、24小時持續(xù)下降，24小時降至最低點，接著開始上升，48小時、72小時持續(xù)上升，整個過程均在正常水平以下；CD86的mRNA的表達在3小時、6小時持續(xù)下降，6小時降至最低點，但在12小時突然升高，超過正常水平，達到最高峰，接著24小時又下降，但在48小時又升高，達到第二個高峰，第二個高峰在正常水平以下，在72小時又下降。結(jié)果表明CD80和CD86的低表達可能是造成成年人早期感染CVB3以后，免疫損傷較輕而病毒直接

8、損傷較重的原因。
　　結(jié)論：
　　1 CVB3感染以后，早期病毒主要對部分小鼠的心肌細胞進行破壞，而并未明顯損傷心臟成纖維細胞，小鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞在體外培養(yǎng)時均有增殖。
　　2正常小鼠的心肌細胞和心臟成纖維細胞中均表達CD80與CD86mRNA。
　　3在小鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞被CVB3感染以后，細胞內(nèi)的CD80與CD86mRNA的表達均會出現(xiàn)波動性的變化，且均有明顯的表達降低。由此我們可以認為感