我國北方漢族HIV-1感染者HLA限制性Gag蛋白CTL應(yīng)答與艾滋疾病進(jìn)展關(guān)系的研究.pdf

1、目的：
　　艾滋病是目前對(duì)人類社會(huì)威脅最大的傳染性疾病之一。盡管抗病毒藥物已經(jīng)普遍應(yīng)用于艾滋病的治療，但由于HIV-1存在高水平的遺傳變異，在抗病毒藥物的作用下病毒易出現(xiàn)耐藥突變，艾滋病仍無法治愈，艾滋病的防治面臨巨大的挑戰(zhàn)。從長遠(yuǎn)策略來說，HIV疫苗是控制艾滋病流行根本途徑之一。HLA限制性CTL應(yīng)答能夠有效的控制HIV病毒復(fù)制，尤其是HLA限制性Gag蛋白CTL應(yīng)答的作用最為突出，Gag蛋白已經(jīng)成為目前以誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛CTL反應(yīng)

2、為基礎(chǔ)的疫苗選用的抗原。由于不同人群遺傳背景及流行毒株的差異，目前國外發(fā)現(xiàn)的一些可能具有保護(hù)作用的CTL應(yīng)答在本人群中不一定起作用，因此尋找我國遺傳背景下具有保護(hù)作用的免疫應(yīng)答，對(duì)于疫苗的研制有重要的意義。
　　HIV-1病毒感染機(jī)體后，不同的個(gè)體表現(xiàn)出不同的疾病進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。影響艾滋病疾病進(jìn)展的因素相對(duì)較多，HIV病毒與宿主免疫應(yīng)答相互作用是決定艾滋病疾病進(jìn)展的主要因素，尤其是宿主HLA限制性CTL應(yīng)答。目前認(rèn)為宿主HLA等位基因是

3、影響HIV疾病進(jìn)展的重要的宿主遺傳學(xué)因素。然而HLA分子具有高度多態(tài)性，且不同人群流行的HIV毒株的特征也不一致，使不同人群中HIV病毒特異性免疫應(yīng)答各異，HLA分子對(duì)HIV疾病進(jìn)展的影響也存在差異。我國HLA與HIV關(guān)系的研究主要集中在HLA與HIV易感性分析，HLA與HIV疾病進(jìn)展的關(guān)系的研究較少。因此，探索我國遺傳背景下HLA與HIV疾病進(jìn)展的關(guān)系，并進(jìn)步一尋找該遺傳背景下可能存在的與緩慢疾病進(jìn)展相關(guān)的免疫應(yīng)答，為HIV疫苗的研究

4、提供理論依據(jù)。
　　越來越多的證據(jù)表明，Gag蛋白特異性免疫應(yīng)答控制HIV病毒的作用最突出，一些特定的HLA型，如HLA-B*57、B*27以及B*13等限制性Gag蛋白特異性CTL應(yīng)答與緩慢疾病進(jìn)展有關(guān)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)與較好臨床結(jié)局相關(guān)的T細(xì)胞表位，如B*57限制的Gag TW10表位和B*27限制性Gag KK10表位，這些表位的發(fā)現(xiàn)對(duì)于疫苗的研究有重要的意義。因此，本課題將研究對(duì)象鎖定到我國北方漢族HIV感染者，研究了1

5、05例長期不進(jìn)展者（long term non-progressors，LTNPs）及321例典型進(jìn)展者(typital progressors，TPs)兩組人群HLA等位基因分布的差異，應(yīng)用logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)HLA-A*30-B*13-C*06與緩慢疾病進(jìn)展相關(guān)，并進(jìn)一步將研究對(duì)象鎖定到與B'亞型感染的HLA-A*30-B*13-C*06陽性的緩慢疾病進(jìn)展者，分析其體內(nèi)可能存在的與延緩疾病進(jìn)展相關(guān)的Gag蛋白特異性CTL應(yīng)答

6、，篩選出的優(yōu)勢(shì)表位可作為疫苗研制的候選資源。
　　方法：
　　一、研究對(duì)象
　　我國北方漢族HIV-1感染者宿主HLA與艾滋病疾病進(jìn)展關(guān)系研究對(duì)象:以我國北方地區(qū)的河南、遼寧以及吉林省為主要現(xiàn)場(chǎng)，其中河南以及吉林省感染者主要是從中國疾病預(yù)防控制中心的國家流行病學(xué)數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)抽取的，而遼寧省感染者主要來自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診，上述患者均為漢族，所有標(biāo)本全部由中國醫(yī)科大學(xué)附屬一院艾滋病確認(rèn)實(shí)驗(yàn)室經(jīng)WB試驗(yàn)確認(rèn)

7、陽性。LTNP判定標(biāo)準(zhǔn)為:感染HIV病毒10年以上，未經(jīng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療，連續(xù)兩次CD4+T細(xì)胞測(cè)定均在500個(gè)/μl以上;TP判定標(biāo)準(zhǔn)為:感染時(shí)間5-10年，未經(jīng)抗病毒治療的情況下CD4+T細(xì)胞范圍在500個(gè)/μl以下。本研究從50000例HIV感染者中篩選出符合LTNP標(biāo)準(zhǔn)的HIV感染者105例，隨機(jī)選取符合TP納入標(biāo)準(zhǔn)的HIV感染者321例，患者標(biāo)本采集時(shí)間為2004年-2008年，每例患者至少隨訪兩次，CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)及病毒載

8、量每6個(gè)月檢測(cè)一次。
　　HLA-A*30-B*13-C*06陽性的HIV感染的緩慢疾病進(jìn)展患者Gag蛋白特異性CTL應(yīng)答特征研究對(duì)象:9例來自河南經(jīng)既往采供血途徑B'亞型感染的緩慢疾病進(jìn)展患者(slow progressors，SP)，均攜帶HLA-A*30-B*13-C*06單倍型。上述患者納入隊(duì)列時(shí)感染時(shí)間超過15年以上，CD4+T細(xì)胞測(cè)定值大于500個(gè)/μl。510099患者接受過兩次母嬰阻斷治療（服用奈韋拉平），治療時(shí)間

9、分別為2006年和2011年的8-12月，除此之外，其余患者均未進(jìn)行抗病毒治療。全血樣本采集時(shí)間從2009-2012年，每例患者至少隨訪3次，應(yīng)用Ficoll-PaqueTM Plus密度梯度離心分離PBMC細(xì)胞，患者510099采集PBMC的時(shí)間距離首次母嬰阻斷治療時(shí)間為46個(gè)月。
　　納入本課題研究的所有患者均簽署了知情同意書，并通過了中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法
　?。ㄒ唬?HLA與

10、HIV疾病進(jìn)展相關(guān)性研究
　　1、CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)
　　將20μl CD4/CD8/CD3 TriTEST試劑加入CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)管中，加入50μl抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACSMULTISET軟件檢測(cè)并進(jìn)行自動(dòng)分析，計(jì)算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細(xì)胞絕對(duì)值及相應(yīng)比值等。
　　2、病毒載量檢測(cè)
　　應(yīng)用Roche公司的COMBAS AmpliPrep/C

11、OMBAS Taqman儀器進(jìn)行HIV病毒載量的檢測(cè)，檢測(cè)范圍為25-1000，000 copies/ml。
　　3、DNA提取
　　外周血白細(xì)胞DNA的提取，使用lmlEDTA抗凝外周靜脈血，采用QIAampDNAMini試劑盒，按照試劑盒說明書標(biāo)準(zhǔn)方法快速提取全基因組DNA200μl。將純化后的DNA置-20℃保存?zhèn)溆谩?br>　　4、HLA等位基因分型檢測(cè)
　　應(yīng)用One Lamda公司的Micro SSPTM試

12、劑盒進(jìn)行HLA分型（PCR-SSP方法）。根據(jù)產(chǎn)物有無及片段的大小，對(duì)照Micro SSPTM HLA-Ⅰ類基因DNA分型判讀卡并結(jié)合One Lamda DNA/LMT軟件確定基因型。
　　5、HLA單倍型分析
　　應(yīng)用在線工具h(yuǎn)ttp://www.hiv.lanl.gov/content/immunology/hla.html進(jìn)行HLA連鎖不平衡分析，即通過Fisher's確切檢驗(yàn)對(duì)連鎖不平衡進(jìn)行篩選，之后應(yīng)用Bonfer

13、roni進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)驗(yàn)證。應(yīng)用Pypop軟件中的Expectation-Maximization(EM)程序進(jìn)行單倍型頻率分析。
　?。ǘ?Gag基因TA克隆測(cè)序
　　1、HIV-1基因組RNA提取
　　病毒基因組RNA使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAgen，German)按操作說明從血漿標(biāo)本提取基因組RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　2、Nested-PCR gag基因擴(kuò)增及T

14、A克隆測(cè)序
　　采用Takara One Step RNA PCR Kit(AMV)擴(kuò)增gag全長。第一輪外側(cè)引物172A(5'-ATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3'628-648 nt of HIV-1HXB2)和 Gag-6(5'-TAATGCTTTTATTTTYTCTTCTGTCAATGGC-3'2651-2621 nt of HIV-1 HXB2)，第二輪內(nèi)側(cè) Gag-763(5'-TGACTAGCGG

15、AGGCTAGAAGG-3'763-783 nt of HIV-1 HXB2)和Gag-5(5'-TTCCYCCTATCATTTTTGGTTTCC-32377-2400 nt of HIV-1 HXB2)。擴(kuò)增條件:第一輪:50℃，30min;94℃變性5 min;94℃30s，50℃30s，72℃2min3個(gè)循環(huán);94℃30s，55℃30s，72℃2min32個(gè)循環(huán);72℃延伸10min.;4℃保溫。第二輪:94℃變性5min;94℃

16、30s，55℃30s，72℃2min30個(gè)循環(huán)72℃延伸10min.;4℃保溫。1％瓊脂糖凝膠電泳后，對(duì)比Marker切下1600bp陽性片段，QIAgen膠純化試劑盒按照操作說明純化回收目的基因片段。純化產(chǎn)物以40ul去離子水洗脫。將其連接入TOPO載體克隆后獲得每一個(gè)患者的gag序列，并進(jìn)行測(cè)序分析。
　　（三） CTL應(yīng)答反應(yīng)
　　1、肽段合成
　　RL42毒株為我國最早分離得到了B'亞型的毒株，并且與我國中部地

17、區(qū)流行的B'亞型毒株有非常密切的進(jìn)化關(guān)系，該序列能夠較好的代表本研究人群的流行的毒株。本研究以RL42為參照，合成覆蓋Gag蛋白的18-20meroverlapping肽，共合成54個(gè)長肽（西安美聯(lián)公司）。此外，結(jié)合患者的自體病毒序列，合成了8個(gè)9-mer的短肽及13個(gè)20-mer變異肽(Sigma-Aldrich(US))。
　　2、ELISPOT法測(cè)定T細(xì)胞應(yīng)答
　　為盡量減少PBMC的用量，本實(shí)驗(yàn)采用矩陣肽段篩選法，即

18、首先利用肽段矩陣對(duì)所有肽段進(jìn)行CTL反應(yīng)初篩。矩陣由肽池組成，每條肽段均會(huì)出現(xiàn)在兩個(gè)不同的肽池中，然后對(duì)反應(yīng)陽性的肽池對(duì)照矩陣表確定陽性肽段。本研究中共混成15個(gè)肽池(7×8)，采用美國BD公司ELISPOT試劑盒測(cè)定。即用相應(yīng)的抗體包被PVDF膜96孔板，每孔加入100μl濃度為1×106/ml的患者PBMC，同時(shí)加入Gag蛋白不同的多肽;陽性對(duì)照孔加入PHA作為質(zhì)控，陰性對(duì)照孔加入完全培養(yǎng)基，37℃，5％CO2孵育18-24小時(shí)。加

19、入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體，室溫孵育2小時(shí)后加入辣根過氧化酶標(biāo)記的鏈菌親和素，1小時(shí)后加入顯色劑，30min后終止反應(yīng)。經(jīng)美國CTL公司ELISPOT分析儀讀取孔中斑點(diǎn)個(gè)數(shù)，減去陰性對(duì)照孔的數(shù)值后根據(jù)孔中細(xì)胞濃度計(jì)算每106個(gè)PBMC中點(diǎn)形成細(xì)胞個(gè)數(shù)，結(jié)果為點(diǎn)形成單位（spot forming unit，SFU）。SFU高于陰性對(duì)照平均值2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差以上且＞50 SFU/106PBMC為陽性。
　　3、免疫逃逸突變驗(yàn)證
　　結(jié)合H

20、LA相關(guān)的氨基酸多態(tài)性位點(diǎn)分析的結(jié)果，分別合成與RL42序列一致的野生肽段及不同氨基酸變異的肽段，對(duì)不同肽段的反應(yīng)濃度進(jìn)行倍比稀釋，稀釋濃度范圍100ng/ml-0.0001ng/ml，采用美國BD公司ELISPOT試劑盒測(cè)定其CTL應(yīng)答的強(qiáng)度，判斷其交叉反應(yīng)活性。
　　結(jié)果：
　　一、我國北方漢族HIV-1感染者宿主HLA等位基因及單倍型與艾滋病疾病進(jìn)展相關(guān)性研究
　　1、本研究在426例北方漢族HIV-1感染者中共

21、檢測(cè)到了14種HLA-A、28種HLA-B以及14種HLA-C等位基因座位上特異性抗原型，常見的HLA-A基因?yàn)?A*02、A*11、A*24、A*30和A*33，HLA-B基因:B*40、B*13、B*15、B*51、B*07和B*35，HLA-C基因?yàn)?C*03、C*07、C*08、C*06、C*12以及C*01。
　　2、本研究在426例北方漢族HIV-1感染者中共檢測(cè)到了25種2-等位基因單倍型以及7種3-等位基因單倍型，

22、A*30-B*13、B*13-C*06、A*30-C*06以及B*40-C*08表現(xiàn)為較強(qiáng)的連鎖不平衡。常見的HLA-A-B-C單倍型為HLA-A*30-B*13-C*06、A*02-B*46-C*01和A*33-B*44-C*14等。
　　3、應(yīng)用logistic回歸分析，排除性別、年齡、亞型、途徑、省份等非遺傳因素的影響后，發(fā)現(xiàn)HLA-A*30-B*13-C*06和HLA-B*67與緩慢疾病進(jìn)展相關(guān)。
　　二、 HLA-

23、A*30-B*13-C*06陽性B'亞型HIV-1感染的緩慢疾病進(jìn)展者Gag蛋白特異性CTL應(yīng)答特征研究
　　1、本研究發(fā)現(xiàn)OLP-15、OLP-16、OLP-2和OLP-48為HLA-A*30-B*13-C*06陽性B'亞型HIV-1感染的緩慢疾病進(jìn)展患者的免疫顯性表位。
　　2、OLP-15/16長肽中可能包含B*13限制性新的B'亞型特有的HL9表位，針對(duì)OLP-15/16長肽有強(qiáng)的CTL應(yīng)答個(gè)體存在HL9表位特異性強(qiáng)

24、的應(yīng)答，HL9表位是HLA-A*30-B*13-C*06陽性的B'亞型感染的緩慢疾病進(jìn)展者免疫顯性表位。
　　3、在HL9表位限制性CTL應(yīng)答選擇壓力下，HL9表位內(nèi)出現(xiàn)了多種氨基酸變異:P146A/S、I147L、S148A/P和P149A/V等，可能與免疫逃逸有關(guān)。
　　4、本研究人群在OLP-2肽中檢測(cè)到了G24M、K28R、K28Q、(K26N，K28R)(R20Q，K28R)等變異，同時(shí)在510109患者縱向隨訪過

25、程中出現(xiàn)了K28Q變異。在OLP-48肽中觀察到了K436R、I437L、I437V、和(K436R，I437V)變異，上述氨基酸變異對(duì)CTL應(yīng)答的影響有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。
　　三、 HLA-A*30-B*13-C*06陽性B'亞型HIV-1感染者Gag蛋白CTL應(yīng)答與艾滋病疾病進(jìn)展關(guān)系的研究
　　1、在510096和510097患者體內(nèi)存在的針對(duì)HL9自體病毒肽強(qiáng)的CTL應(yīng)答以及廣泛的交叉反應(yīng)活性可能與兩例患者較高的CD4+

26、T細(xì)胞計(jì)數(shù)及較低的病毒載量有關(guān)，而510099患者針對(duì)HL9自體病毒肽無應(yīng)答，交叉反應(yīng)活性差。
　　2、510082、510084及510110患者患者體內(nèi)存在OLP-2自體病毒肽強(qiáng)的CTL應(yīng)答;510082和510084針對(duì)(K26N，K28R)變異肽表現(xiàn)出不同的應(yīng)答。510109患者在隨訪過程中HIV病毒出現(xiàn)了K28Q變異并成為優(yōu)勢(shì)株，該變異可能與免疫逃逸有關(guān)，伴隨著CD4+T細(xì)胞的顯著下降及VL上升。
　　3、5101

27、21和510013患者疾病進(jìn)展緩慢，體內(nèi)存在OLP-48自體病毒肽強(qiáng)的CTL應(yīng)答，并具有較好的交叉反應(yīng)活性。
　　4、HLA-A*30-B*13-C*06陽性的B'亞型HIV-1感染的緩慢疾病進(jìn)展者中存在HL9、OLP-2及OLP-48三個(gè)免疫顯性表位中至少一個(gè)自體病毒肽強(qiáng)的CTL應(yīng)答，可能在控制HIV病毒中發(fā)揮了一定的作用。
　　結(jié)論：
　　1、我國北方漢族HIV-1感染者中，HLA-A*30-B*13-C*06和H

28、LA-B*67與艾滋病緩慢疾病進(jìn)展相關(guān)。
　　2、HL9、OLP-2以及OLP-48為HLA-A*30-B*13-C*06陽性B'亞型HIV-1感染的緩慢疾病進(jìn)展者的免疫顯性表位，HL9表位為B*13限制性新的B'亞型特有的表位。
　　3、HLA-A*30-B*13-C*06陽性B'亞型HIV-1感染的緩慢疾病進(jìn)展者中存在HL9、OLP-2及OLP-48三個(gè)免疫顯性表位中至少一個(gè)自體病毒肽強(qiáng)的CTL應(yīng)答，可能在控制HIV病毒