抗SARS病毒人源Fab抗體的制備研究.pdf

1、SARS冠狀病毒引起的嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)綜合癥，具有很高的傳染性和致死率，目前尚無特異性預(yù)防及治療藥物，研究抗SARS病毒人源抗體被動(dòng)免疫，將有助于對SARS病人的救治。 目前噬菌體抗體庫技術(shù)已成為人源抗體制備的強(qiáng)有力工具，它易于操作，篩選容量大，有利于獲得一些稀有抗體，并可直接獲得完全人源的單克隆抗體。本研究工作可分為4個(gè)部分：抗體庫的構(gòu)建、抗體庫的富集及特異性單克隆抗體的篩選、中和抗體M1A的可溶性表達(dá)及純化、M1A抗體活性的定量

2、分析。 一、噬菌體抗體庫的構(gòu)建 建立人抗SARS病毒Fab抗體基因庫的淋巴細(xì)胞來源于恢復(fù)期SARS患者的外周血，免疫熒光及體外中和試驗(yàn)檢測抗SARS病毒抗體的滴度≥1：256及1：64，這為建立可能篩選出高親和力的抗體基因庫創(chuàng)造了條件。提取淋巴細(xì)胞RNA，利用RT-PCR方法克隆出7條重鏈Fd段抗體基因和9條輕鏈抗體基因，依次將輕鏈基因混合物和重鏈基因混合物酶切后連入載體pComb3內(nèi)，構(gòu)建成人源Fab分子噬菌體表面呈現(xiàn)

3、文庫，庫容約2×106。 二、抗體庫的富集及特異性單克隆抗體的篩選 目前大量研究結(jié)果表明，SARS病毒的4個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白中，S蛋白的主要功能是通過特異受體介導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞結(jié)合，引起細(xì)胞融合，它是宿主免疫應(yīng)答的重要靶位。從抗體庫中篩選抗SARS病毒中和抗體，以S蛋白作為篩選靶標(biāo)，對抗體庫進(jìn)行了富集篩選，經(jīng)過4輪的“吸附結(jié)合-洗脫-擴(kuò)增”過程，富集了抗S蛋白噬菌體抗體庫。 人源單克隆抗體的篩選分為兩個(gè)過程，結(jié)合特異性

4、和中和活性的篩選。首先確立了可靠的雙抗體夾心ELISA方法檢測抗S蛋白特異性抗體。從50株隨機(jī)挑取的Fab抗體克隆中篩選出12株抗S蛋白特異性抗體，然后測定其對SARS病毒的中和活性，篩選到一株抗體，有明顯的抗SARS病毒中和活性，可推遲細(xì)胞病變的發(fā)生，編號為M1A；基因測序分析表明M1A抗體的輕鏈為VK3a家族基因，重鏈為VH3家族基因。 三、M1A抗體的可溶性表達(dá)及純化 將M1A基因克隆入載體PET32a，首先通過誘

5、導(dǎo)前不同菌體濃度及不同誘導(dǎo)溫度條件下蛋白表達(dá)量的差異檢測，確定合適的誘導(dǎo)表達(dá)條件，進(jìn)行表達(dá)。然后用親和層析法對上清和菌體中的蛋白進(jìn)行提取，從200m;菌液中得到了10mg的抗體蛋白，非變性聚丙烯酰胺電泳顯示產(chǎn)物為單一條純化帶，表明表達(dá)純化后獲得了高純度的M1A抗體。 四、M1A抗體結(jié)合活性及中和活性的定量分析 經(jīng)雙抗體夾心ELISA及免疫熒光法檢測證實(shí)M1A抗體可特異性結(jié)合S蛋白。在用100TCID50的SARS病毒，0

6、.25mg/ml抗體濃度下進(jìn)行中和試驗(yàn)，可使細(xì)胞病變時(shí)間推遲2d；而在0.5mg/ml濃度下，可完全中和100TCID50的SARS病毒，連續(xù)7d實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞無病變發(fā)生。用實(shí)時(shí)定量PCR對0.5mg/mlM1A作用的實(shí)驗(yàn)組和病毒對照組中每日病毒量的差異進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組中的病毒量顯著低于對照組，用分子生物學(xué)方法確定了M1A抗體的抗SARS病毒中和活性。 在此基礎(chǔ)上，對M1A抗體的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行初步研究。2C5為具有中和抗體活

7、性的鼠源抗SARS病毒單抗，針對的抗原結(jié)合位點(diǎn)在SARS病毒S1蛋白上350～535氨基酸序列之間(SARS病毒與宿主細(xì)胞表面受體的結(jié)合位點(diǎn))。競爭ELISA結(jié)果表明M1A可部分抑制2C5與S蛋白的結(jié)合，但不能完全抑制，說明M1A抗體的結(jié)合表位可能與SARS病毒及宿主細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)。 人源抗SARS病毒中和抗體的研究目前國內(nèi)還未有報(bào)道，本研究利用噬菌體表面展示技術(shù)，成功地制備了抗SARS病毒中和抗體，對于探索SARS感染的