隱孢子蟲特異性人源抗體Fab片段的制備和研究.pdf

1、隱孢子蟲屬于頂復門胞內寄生機會致病性原蟲，可感染人和多種動物，引起以腹瀉為主要癥狀的隱孢子蟲病，是危害全球的公共衛(wèi)生問題，至今仍無有效的控制和治療手段。大量研究表明，高滴度牛初乳(HBC)、高滴度牛初乳免疫球蛋白(HBCIg)、一系列針對隱孢子蟲表面致病相關蛋白的特異性多克隆抗體及鼠源單克隆抗體等均可在動物或人體內產生抗隱孢子蟲作用，證明了被動免疫治療隱孢子蟲感染的有效性，故本研究擬進一步研制隱孢子蟲特異性人源抗體。 首先從奶牛

2、糞便中分離、鑒定、純化獲得微小隱孢子蟲卵囊，感染SCID小鼠保種；以微小隱孢子蟲卵囊免疫志愿者，獲得含有較高滴度抗微小隱孢子蟲IgG抗體的外周血，從中分離淋巴細胞，利用工程抗體技術構建非依賴性克隆滴度為8×106的人抗隱孢子蟲免疫球蛋白G基因文庫；選擇位于隱孢子蟲胞外發(fā)育階段蟲體表面和頂端、直接參與蟲體對宿主細胞的吸附和入侵過程的糖蛋白gp40／15作為抗體庫篩選的抗原靶的，應用DNA重組技術將擴增得到的Cpgp40／15基因克隆入原核

3、表達載體pETl9b中，轉化宿主菌、誘導表達重組蛋白，純化得到可被含有抗微小隱孢子蟲特異性抗體的血清識別、具有特異免疫原性的重組抗原gp40／15，每100mi培養(yǎng)菌液中可獲得高純度重組蛋白3．6mg；采用克隆印跡法和ELISA對抗體庫進行多輪篩選，共篩選克隆數(shù)約為1．01×106個，經ELISA、IFA等方法反復驗證，最終獲得兩個陽性克隆，分別命名為Agp40—1和Agp40—2；Agp40．1的輕鏈可變區(qū)近似系為A20，基因同源性為

4、95％；重鏈可變區(qū)近似系為VH3-30，基因同源性為92％；Agp40-2的輕鏈可變區(qū)近似系為012，基因同源性為97％；重鏈可變區(qū)近似系為VH3-30，基因同源性為92％；分別對兩個陽性克隆進行大量表達，并以金屬螯合親和層析法進行純化，得到重輕鏈結構完整、純度較高的抗體Fab片段，得量為1mg/L培養(yǎng)液；經ELSIA、斑點印跡、免疫印跡、IFA等檢測證實兩個純化Fab片段均可特異性識別天然及重組微小隱孢子蟲表面抗原；Biacore檢測